米邦塔仙人掌果膠對小鼠慢性不可預知溫和應激模型學習記憶的影響

余玲 肖同楚 屈亞莉 湛進進 郭蓮軍

[摘要] 目的 研究本實驗室分離提取的米邦塔仙人掌果膠（MCP）對小鼠慢性溫和應激（CUMS）模型學習記憶影響。 方法 采用Morris水迷宮（MWM）對60只小鼠進行篩選后按照隨機數字表分為5組（每組12只）：正常對照組、CUMS模型組、MCP低劑量組（50 mg/kg）、MCP中劑量組（100 mg/kg）、MCP高劑量組（200 mg/kg）。建立CUMS模型，造模結束96 h后進行MWM實驗。 結果 學習訓練結束時，模型組小鼠逃逸潛伏期和游泳總路程顯著長于對照組（P < 0.01），在靶標象限游泳路程/游泳總路程和穿越平臺次數均明顯低于對照組（P < 0.05或P < 0.01），MCP中、高劑量組小鼠逃逸潛伏期與模型組比較，差異有統計學意義（P < 0.01），游泳總路程與模型組比較，差異有統計學意義（P < 0.05），穿越平臺的次數顯著增加（P < 0.05），而模型組、MCP各劑量組的小鼠游泳速度比較差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 MCP對CUMS小鼠學習記憶具有一定的改善作用。

[關鍵詞] 米邦塔仙人掌果膠；慢性不可預知溫和應激；學習記憶；小鼠

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0014-05

Effect of milpa alta cactus pectin on learning and memory in mice exposed to chronic unpredictable mild stress

YU ling1 XIAO Tongchu1 QU Yali2 ZHAN Jinjin3 GUO Lianjun3

1.Department of Obstetrics and Gynecology and Chronic Disease Management， Yiling District Maternal and Child Health Hospital， Hubei Province， Yichang 443100， China； 2.Department of Interventional Ultrasound， Wuhan Medical Treatment Center， Hubei Province， Wuhan 430023， China； 3.Department of Pharmacology， School of Basic Medical Sciences， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Hubei Province， Wuhan 430030， China

[Abstract] Objective To explore the effect of milpa alta cactus pectin （MCP） on learning and memory in mice exposed to chronic unpredictable mild stress （CUMS）. Methods A total of 60 qualified mice selected by Morris water Maze （MWM） were randomly divided into 5 groups using the random number table （12 mice in each group）； Control group， CUMS group， MCP low dose group （50 mg/kg）， MCP medium dose group （100 mg/kg）， and MCP high dose group （200 mg/kg）. The MWM test was conducted to evaluate the ability of learning and memory in 96 hours after the mice were exposed to CUMS. Results At the end of learning acquisition， compared with the control group， the escape latency and total swimming distance of CUMS group were significantly increased （P < 0.01）， while the target quadrant swimming distance/total swimming distance and the time of crossing platform were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with CUMS group， MCP in medium dose group （100 mg/kg） and high dose group （200 mg/kg） significantly reduced the escape latency （P < 0.01） and the total swimming distance （P < 0.05）， but not for the target quadrant swimming distance/total swimming distance （P > 0.05）. CUMS and MCP treatment had no effect on the swimming speed in mice （P > 0.05）. Conclusion MCP shows an improving effect on learning and memorizing in mice exposed to CUMS.

[Key words] Milpa alta cactus pectin； Chronic unpredictable mild stress； Learning and memory； Mice

慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型能很好地模擬人類抑郁癥中慢性、低水平應激可導致的疾病發生，是一種用于研究疾病發生的良好動物模型[1]。CUMS造模過程中所用的各種應激因子能較好地模擬人類抑郁癥狀的發生[2]；同時也能較好地模擬抑郁患者其他的一些神經系統功能改變，如認知能力下降等；大量研究證實，CUMS導致海馬依賴性認知功能損傷[3-5]。目前國內外研究者廣泛應用此模型評價藥物對抑郁癥及相關學習記憶損傷的改善作用[6-7]。果膠（Pectin）是一種復雜的多糖，其主要成分是部分甲酯化的a（l，4）-D-聚半乳糖醛酸[8]，大量研究顯示多種植物果膠有較好的抗氧化、抗炎、抗潰瘍、抗癌和調節免疫的作用[9-12]。關于米邦塔仙人掌果膠（MCP）對中樞系統的影響報道較少。因此本文探討MCP對慢性溫和型應激模型小鼠學習記憶是否有改善作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

MCP，棕色粉末，由華中科技大學同濟醫學院藥理學系提取，用雙蒸水溶解配制成低、中、高三種濃度（5、10、20 mg/mL），調節pH值至中性。水迷宮試驗系統及分析軟件（中國醫學科學院藥物研究所）。

1.2 實驗動物與分組

15～20 g清潔級的健康雄性昆明種小鼠，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（鄂）2008-0007，合格證號：00020736]，動物飼養：12 h晝夜交替，室溫（24±2）℃，空氣濕度（50±10）%，除造模及必要的斷水斷食外，小鼠均可自由進水進食。

采用Morris水迷宮（MWM）檢測小鼠空間學習記憶能力，將篩選合格的60只小鼠按隨機數字表法分為5組（每組12只，造模前各組小鼠學習記憶能力比較，差異無統計學意義）：①正常對照組；②CUMS模型組；③MCP低劑量組（50 mg/kg）；④MCP中劑量組（100 mg/kg）；⑤MCP高劑量組（200 mg/kg）。正常對照組：不進行任何應激處理；模型組：持續6 周給予1.3中的應激處理；果膠處理組：各組均進行應激處理，期間每天上午9：00～10：00灌胃給藥，灌胃體積為0.1 mL/10 g，模型組給予同等體積的雙蒸水。

1.3 慢性不可預知溫和應激模型制備

在造模過程包括以下11種應激因子：①斷水16 h時，②斷食16 h，③45°傾斜鼠籠4 h，④潮濕墊料24 h，⑤通宵照明，⑥2 h-2 h時晝夜交替，⑦晝夜顛倒，⑧陌生氣味4 h，⑨4℃水溫游泳，⑩陌生氣味4 h，■活動限制2 h。以周為時間單位，每天給予2～3種不同刺激因子進行應激，每次應激時間間隔48 h，應激處理共歷時6周。

1.4 Morris水迷宮實驗

在一間光線均勻的實驗室內，所有陳設位置相對固定。實驗前，先將小鼠放在實驗室1 h以適應。實驗條件：室溫25℃，水溫18～22℃。通過攝像系統實時拍攝小鼠的游泳軌跡，然后經計算機系統軟件計算游泳速度及游泳總路程等。

實驗分兩部分進行，①定位航行實驗：小鼠每天訓練4次，連續訓練5 d，在10：00～14：00進行實驗。實驗時小鼠分別從4個不同的入水點，并將小鼠頭朝游泳桶壁入水，任其游泳，直到找到平臺，每次訓練間隔為10 min。設定每次試驗時間為60 s，小鼠在60 s內達到平臺的時間即逃逸潛伏期被記錄下來；如果60 s內沒能找到平臺的記其潛伏期為60 s。②空間探索實驗：實驗第6天12：00進行空間探索實驗，撤出平臺，設定試驗時間為30 s，小鼠從第4象限中間點入水，記錄小鼠穿越目標區域的次數。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件處理實驗數據，實驗數據均以均數±標準差（x±s）表示，重復測量實驗數據采用方差分析并結合LSD檢驗或Tamhane's T2檢驗比較各指標的組間差異，單因素方差分析并結合LSD檢驗比較空間探索實驗中采用組間差異，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MCP對小鼠CUMS損傷空間學習記憶能力的影響

小鼠在連續訓練5 d的過程中，發現在訓練的第1天，各組小鼠尋找靶標所需時間較長，而經過訓練后，各組小鼠尋找靶標的時間均有縮短。結果發現從第2天起，CUMS模型組明顯長于正常對照組，差異有統計學意義（P < 0.01）。在訓練第5天，MCP中、高劑量處理組小鼠逃逸潛伏期顯著低于CUMS模型組（P < 0.01）。見表1。

2.2 MCP對小鼠CUMS模型游泳速度的影響

從實驗數據中可以看出，學習訓練第1天，各組小鼠游泳速度均較快，隨著訓練次數的增加從第2天開始，各組游泳速度趨于穩定。學習訓練第5天，正常對照組、CUMS模型組、MCP各劑量組的游泳速度之間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 MCP對小鼠CUMS模型游泳總路程的影響

實驗發現小鼠在訓練第1天，繞迷宮壁游泳的時間較長，導致游泳總路程較長；隨著訓練次數的增加，小鼠在入水后就有目的性的向著平臺方向游去，其游泳總路程縮短。在訓練第5天，CUMS模型組的游泳總路程與正常對照組比較差異有統計學意義（P < 0.01）；而MCP中、高劑量組的游泳總路程顯著短于CUMS模型組（P < 0.05）。見表3。

2.4 MCP對小鼠CUMS模型在目標象限游泳路程/游泳總路程的影響

本實驗結果發現，小鼠在訓練第5天，CUMS模型組小鼠在目標象限游泳路程/游泳總路程正常對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；CUMS模型組、MCP各劑量組小鼠在目標象限游泳路程/游泳總路程，組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表4。

2.5 MCP對小鼠CUMS空間記憶能力的影響

空間探索實驗通過檢測30 s內小鼠穿越靶標所在區域的次數評價小鼠的空間記憶能力。本結果發現，正常對照組，CUMS模型組，MCP低、中、高劑量組次數分別為（2.69±0.44）、（1.50±0.27）、（1.70±0.42）、（2.60±0.27）、（2.70±0.42）次。CUMS模型組小鼠穿越越平臺次數與正常對照組比較（P<0.01）；而MCP中、高劑量組小鼠穿越次數與CUMS型組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。

3 討論

MWM實驗目前被廣泛用于評價嚙齒目動物的空間學習記憶能力的一種研究手段，已有文獻報道CUMS模型損傷動物空間學習記憶能力[7]，故本實驗中用MWM評價MCP對CUMS小鼠空間學習記憶能力的改善作用。已有臨床報道，抑郁癥患者往往伴有典型的學習記憶能力減退[13]，獲取的信息在存儲和再提取過程中顯示出異常。本實驗通過水迷宮實驗發現，小鼠經過一段時間慢性不可預知應激后，尋找目標的時間（即逃逸潛伏期）明顯延長，與正常對照組比較，差異有統計學意義；提示小鼠空間學習能力減退。另一方面，通過檢測小鼠在靶標象限的穿越次數，也就是空間探索試驗，發現CUMS模型組小鼠在靶標象限穿越的次數與正常對照組，明顯減少，表明小鼠經慢性不可預知應激后，在空間學習能力減退的同時，空間記憶能力也受到損傷。而且通過檢測小鼠在目標象限的游泳總路程/游泳總路程，發現CUMS模型組與正常對照組游泳速度和游泳總路程與正常對照組比較，差異無統計學意義；在目標象限的游泳總路程與游泳總路程的比值亦明顯增加，說明慢性應激損傷對小鼠運動能力并無明顯影響，而對學習記憶能力損傷更為明顯，與文獻報道一致[14-15]。有關慢性應激損傷對空間學習記憶的影響，也有不同的報道，認為可使學習記憶能力增強[16]，其原因可能與使用的動物種系和應激方式不同有關。

國外研究顯示，仙人掌具有神經保護和提高長期記憶的作用，其機制可能是提高了腦源性神經營養因子（BDNF）、磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（CREB）、磷酸化細胞外信號調節激酶（pERK）的表達水平[17-19]。李萬銘等[20]報道仙人掌多糖可劑量依耐性改善慢性腦低灌注導致的小鼠學習記憶功能減退，明顯改善小鼠海馬CA1區細胞形態學和細胞存活率；潘建萍等[21]發現仙人掌多糖能夠減輕缺氧/缺糖再給氧所致大鼠海馬神經細胞的凋亡作用，其機制可能與其增強機體的抗自由基抗氧化能力有關。李莉梅等[22]發現野生仙人掌多糖對DPPH·、N02-有較強的清除作用，并具有一定的還原能力，該團隊認為這是一種具有開發潛力的抗氧化、防衰老的功能性食品或藥物。本研究結果顯示米邦塔仙人掌果膠100 mg/kg和200 mg/kg不影響小鼠游泳速度影響，但顯著降低CUMS小鼠逃逸潛伏期、游泳總路程，而且呈現劑量依賴性，表現出良好的學習記憶保護作用。

綜上所述，CUMS模型可導致動物抑郁行為，并表現出明顯的學習記憶能力的降低。給予MCP治療后能顯著改善抑郁模型動物的行為學與學習記憶能力的異常，表現出改善抑郁造成的認知功能損傷的作用，其具體機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2015-10-30 本文編輯：趙魯楓）