間歇高壓氧暴露對小鼠肺、腦組織中抗氧化蛋白Peroxiredoxin 6含量的影響

徐淳 李潤平

[摘要] 目的 考察間歇吸氧對小鼠肺、腦組織中抗氧化蛋白Peroxiredoxin 6（Prx 6）含量的影響，探討間歇吸氧對抗氧中毒的機制。 方法 將小鼠隨機分為正常組、持續暴露后即刻組、間歇暴露后即刻組、持續暴露后24 h組和間歇暴露后24 h組，通過不同暴露方法，分別取小鼠肺、腦組織采用免疫組織化學和Wester blot等方法測定Prx 6的含量。 結果 經高壓氧暴露的各組小鼠肺組織中Prx 6的含量均明顯高于正常組（P < 0.05或P < 0.01），持續暴露后即刻組與間歇暴露后即刻組差異無統計學意義（P > 0.05），間歇暴露后24 h組含量明顯高于持續暴露后24 h組（P < 0.01），并且高于各自對應的暴露后即刻檢查的結果（P < 0.01）。經高壓氧暴露的各組小鼠腦組織中Prx 6的含量均明顯低于正常組（P < 0.01），持續暴露后即刻組與間歇暴露后即刻組差異無統計學意義（P > 0.05），間歇暴露后24 h組與持續暴露后24 h組高于各自對應的暴露后即刻檢查的結果（P < 0.05），且間歇暴露后24 h組含量接近正常組（P > 0.05）。 結論 間歇吸氧可以促進肺、腦組織中Prx 6的含量增加，從而增強組織的抗氧化能力。

[關鍵詞] Peroxiredoxin 6；高壓氧；間歇吸氧；氧中毒

[中圖分類號] R459.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0018-04

Effects of intermittent hyperbaric oxygen exposure on the contents of peroxiredoxin 6 in the lung and brain of mice

XU Chun1 LI Runping2▲

1.Department of Outpatient， the 61565 Troops of People's Liberation Army， Beijing 102699， China； 2.Department of Diving Medicine， Faculty of Naval Medicine， the Second Military Medical University， Shanghai 200433， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of intermittent hyperbaric oxygen exposure on the contents of peroxiredoxin 6 （Prx 6） in the lung and brain of mice， and to explore the mechanism underlying intermittent hyperbaric oxygen exposure protecting against oxygen toxicity. Methods Mice were randomly divided into normal group， immediate group after continuous exposure， immediate group after intermittent exposure， live 24 h group after continuous exposure， live 24 h group after intermittent exposure. The content of Prx 6 in the lung and brain were detected using immunohistochemistry and western blot analysis respectively. Results In lung， compared with normal group， Prx 6 contents of all mice experiencing hyperbaric oxygen exposure were increased （P < 0.05 or P < 0.01）. There was no significant difference between immediate group after continuous exposure and immediate group after intermittent exposure （P > 0.05）. The Prx 6 content of live 24 h group after intermittent exposure was significantly higher than that of live 24 h group after continuous exposure （P < 0.01）， and the result in each live 24 h group was also higher than that in each immediate group （P < 0.01）. In brain， compared with normal group， Prx 6 contents of all mice experiencing hyperbaric oxygen exposure were decreased （P < 0.01）. There was no significant difference between immediate group after continuous exposure and immediate group after intermittent exposure （P > 0.05）. The Prx 6 contents in each live 24 h group was higher than that in each immediate group （P < 0.05）， and the content of live 24 h group after intermittent exposure was close to the normal group （P > 0.05）. Conclusion Intermittent hyperbaric oxygen exposure can facilitate the expression of Prx 6 in lung and brain， and this may be related to the enhanced ability to protect against oxygen toxicity.

[Key words] Peroxiredoxin 6； Hyperbaric oxygen； Intermittent hyperbaric oxygen exposure； Oxygen toxicity

近年來發現過氧化物酶家族成員中的抗氧化蛋白（peroxiredoxin，Prxs）在體內廣泛分布，現已知在哺乳動物中至少存在6種Prx亞型（Prx Ⅰ～Ⅵ）。它們利用包含巰基的蛋白，將過氧化物還原，起到降解毒性的作用[1-5]。高壓氧暴露時，體內各種產生氧自由基的環節被激活，生成大量的活性氧（ROS），這些活性氧一方面可以氧化體內各種物質而導致組織損傷，另一方面也可以啟動和參與細胞內多種物質代謝和信號轉導過程，具有強大的病理生理學功能[6-10]。間歇吸氧很可能通過激活Prxs，進而降解活性氧，實現其對抗氧中毒發生的作用。故本研究將探討間歇高壓氧暴露對小鼠肺、腦組織中抗氧化蛋白（Prx 6）含量的影響，以期為闡明間歇吸氧預防氧中毒的作用機制提供部分科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與氣體

動物實驗用高壓艙，設計工作壓力為2.5 MPa。醫用純氧，氮氧混合氣購于上海市江南氣體公司。

1.2 動物及分組

購入10月齡雄性C57BL/6小鼠共50只，體重20～22 g，合格證號：醫動字第14-2-6號。飼予正常飼料，自由飲水和12 h照明循環，適應2周后進行實驗，隨機分為5組，包括正常組（未經高壓氧暴露）、持續暴露后即刻組（持續暴露法結束即刻取材）、間歇暴露后即刻組（間歇暴露法結束即刻取材）、持續暴露后24 h組（持續暴露法結束繼續存活24 h后取材）和間歇暴露后24 h組（間歇暴露法結束繼續存活24 h后取材），每組10只并作相應標記。

1.3 高壓氧暴露方法

①持續暴露法：將持續暴露后即刻組和持續暴露后24 h組小鼠勻速加壓至280 kPa，持續暴露至6 h后停止高壓氧暴露，將艙內壓力勻速減至常壓出艙。②間歇暴露法：將間歇暴露后即刻組和間歇暴露后24 h組小鼠在暴露過程中，交替呼吸60 min的O2和30 min的氮氧混合氣（氧濃度為20%），至6個循環后停止暴露減壓出艙。

1.4 免疫組織化學法檢測Prx 6在肺和腦組織中的表達

小鼠經生理鹽水和多聚甲醛灌注后，取肺和腦組織，常規石蠟包埋，制片。免疫組化采用SP法，切片常規脫蠟至水，微波抗原修復，3% H2O2孵育，以消除內源性過氧化物酶，正常兔血清封閉，一抗為兔抗鼠多克隆抗體（購自abcam公司），1∶500稀釋，4℃孵育過夜，再以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（購自Sant Cruz公司），37℃孵育60 min，用DAB顯色，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對照。免疫組化結果掃描輸入電腦后每組隨機選擇20個細胞用圖像分析系統對各組灰度值進行測定。

1.5 Western blot分析Prx 6在肺和腦組織中的表達

采用頸椎脫臼法處死，快速取小鼠肺和腦組織，經漂洗吸干水分后置入4℃組織蛋白裂解緩沖液（購自凱基生物公司）中勻漿，9500 r/min離心20～30 min，離心半徑12 cm，吸取上清，測定蛋白濃度，用十二烷基硫酸鈉，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白至PVDF膜（購自AMERSCO公司），用含脫脂奶粉的TBST緩沖液包被PVDF膜2 h后，浸入含脫脂奶粉的TBST稀釋兔抗鼠多克隆抗體（購自abcam公司）1∶500稀釋，4℃孵育過夜，TBST漂洗后轉入含脫脂奶粉的TBST稀釋的二抗（購自Sant Cruz公司）中2 h，TBST充分漂洗后，ECL發光法（購自Pierce Biotechnology公司）檢測Prx 6蛋白表達水平。內參照用小鼠源單克隆抗體β-actin（購自Sigma公司），二抗為羊抗小鼠IgG（購自康成生物公司），均為1∶2000稀釋。結果掃描入電腦后用圖像分析系統分別測定各組Prx 6蛋白和β-actin的積分灰度值，用各組Prx 6蛋白積分灰度值除以相應的β-actin積分灰度值獲得相對積分灰度值，做圖時以正常組為1，其余各組以其與正常組相對比值計算。

1.6 統計學方法

用SPSS 11.5統計軟件對結果進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高壓氧暴露對小鼠肺組織中Prx 6含量的影響

免疫組化結果顯示，Prx 6在肺組織中主要分布于肺泡上皮細胞、細支氣管上皮細胞以及血管上皮細胞中。免疫組化結果與Western blot檢測結果均示：經高壓氧暴露的各組小鼠肺組織中Prx 6的含量均明顯高于正常組（P < 0.05或P < 0.01），持續暴露后即刻組與間歇暴露后即刻組差異無統計學意義（P > 0.05），間歇暴露后24 h組含量明顯高于持續暴露后24 h組（P < 0.01），并且高于各自對應的暴露后即刻檢查的結果（P < 0.01）。見圖1～3。

A：正常組；B：持續暴露后即刻組；C：間歇暴露后即刻組；D：持續暴露后24 h組；E：間歇暴露后24 h組

圖1 小鼠肺組織中Prx 6的免疫組化檢測結果（200×）

A：正常組；B：持續暴露后即刻組；C：間歇暴露后即刻組；D：持續暴露后24 h組；E：間歇暴露后24 h組

圖2 小鼠肺組織中Prx 6的Western blot檢測結果

與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與持續暴露后24 h組比較，▲▲P < 0.01

圖3 小鼠肺組織中Prx 6的Western blot檢測結果統計分析（n = 4）

2.2 高壓氧暴露對小鼠腦組織中Prx 6含量的影響

免疫組化結果顯示，Prx 6在腦組織中主要分布于星形膠質細胞與少突等膠質細胞中。免疫組化結果與Western blot檢測結果均顯示：經高壓氧暴露的各組小鼠腦組織中Prx 6的含量均明顯低于正常組（P < 0.01），持續暴露后即刻組與間歇暴露后即刻組差異無統計學意義（P > 0.05），間歇暴露后24 h組高于持續暴露后24 h組（P < 0.05），并且高于各自對應的暴露后即刻檢查的結果（P < 0.05），且間歇暴露后24 h組含量接近正常組（P > 0.05）。見圖4～6。

A：正常組；B：持續暴露后即刻組；C：間歇暴露后即刻組；D：持續暴露后24 h組；E：間歇暴露后24 h組

圖4 小鼠腦組織中Prx 6的免疫組化檢測結果（100×）

A：正常組；B：持續暴露后即刻組；C：間歇暴露后即刻組；D：持續暴露后24 h組；E：間歇暴露后24 h組

圖5 小鼠腦組織中Prx 6的Western blot檢測結果

與正常組比較，**P < 0.01；與持續暴露后24 h組比較，▲P < 0.05

圖6 小鼠腦組織中Prx 6的Western blot檢測結果統計分析（n = 4）

3 討論

大量實踐經驗證明，采用間歇性短時間吸入氧分壓相對較低的混合氣或壓力相等的壓縮空氣，可以有效延緩長時間連續吸高壓氧過程中發生氧中毒的時間。但目前國內外對其機制的研究甚少[11-12]。Frank等[13]發現，將大鼠暴露于96～101 kPa（0.95～1.0 ata）的氧氣中48 h，然后給予24 h的空氣“休息期”，它們可以耐受以后3～7 d的高氧暴露，僅有輕度肺水腫，無死亡。氧耐力提高的誘導作用與“休息期”后再次暴露于高壓氧時肺內的抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及谷胱甘肽過氧化物酶活力的顯著增加相關。即使將吸空氣的“休息期”時間縮短到6 h，所有大鼠在再次暴露于高壓氧時都能存活。Harabin等[14]研究指出間歇暴露組的實驗鼠驚厥潛伏期和生存時間均明顯高于持續暴露組。這些都提示間歇暴露可能與提高氧耐力的機制有關，在能夠引起相當毒性的高壓氧暴露之后，給予適當的空氣恢復期，能在隨后的高壓氧暴露中誘導抗氧化酶的產生，從而對抗氧中毒。

研究表明，Prx 6是具有非硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶和非鈣離子依賴性磷脂酶A雙重功能的蛋白[15-19]。它可以利用還原因子谷胱甘肽還原有機或無機的氧化物如過氧脂質和H2O2等。本研究結果顯示，長時間高壓氧暴露可刺激機體肺組織中Prx 6含量明顯升高，并且暴露結束小鼠繼續存活24 h后，含量升高得更加明顯，這是機體對高壓氧暴露引起的氧化性肺損傷的一種保護作用。在腦組織中，高壓氧暴露可以導致Prx 6含量明顯降低，筆者分析這可能與Prx 6在肺組織表達比腦組織高，研究發現Prx 6在肺泡Ⅱ型上皮細胞和細支氣管的Clara細胞中存在高度表達[20-21]，也可能與不同的間歇暴露方案或者暴露模式導致抗氧化酶活性發生不同改變有關。但暴露結束24 h后，Prx 6含量較暴露結束后即刻顯著升高，同樣表明機體存在一個大量產生Prx 6來對抗和修復氧化性損傷的過程。這些結果表明Prx 6對高壓氧導致的氧化損傷反應較為敏感，是一個較為快速產生的抗氧化分子。研究結果同時顯示，高壓氧暴露結束24 h后，間歇暴露組肺、腦組織中Prx 6的含量更高，表明間歇吸氧可以更加有力地促進機體產生Prx 6來對抗氧化損傷，這可能與其能夠有效延緩氧中毒發生有較為密切的聯系。

與已有的間歇吸氧引起機體內各種與氧化還原有關的酶活性或含量變化存在升高與降低等不一致情況不同[14]，筆者的初步研究顯示，間歇吸氧可以刺激機體內與氧中毒密切相關的肺、腦組織中Prx 6的含量顯著升高，這一結果為從間歇吸氧提高機體抗氧化能力的角度闡明其作用機制找出了一個新的聯結點，也為進一步尋找能夠有效對抗氧中毒的措施提供了新的關注點，這對于深入闡明間歇吸氧對抗氧中毒的機制具有重要意義。

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（收稿日期：2015-11-10 本文編輯：張瑜杰）