低強(qiáng)度壓力感受器刺激治療心房顫動(dòng)的實(shí)驗(yàn)研究

屈園園 江洪

[摘要] 目的 探討低強(qiáng)度頸動(dòng)脈竇壓力感受器電刺激（LL-CBS）對(duì)9小時(shí)快速心房起搏（9hRAP）所致的心房顫動(dòng)（AF）的影響。 方法 14只比格犬（7～9 kg）麻醉后分為對(duì)照組（6只）和LL-CBS組（8只）。將多電極導(dǎo)管縫合于心房和肺靜脈。所有動(dòng)物均接受9hRAP，LL-CBS組的動(dòng)物在行9hRAP同時(shí)給予持續(xù)的LL-CBS，將80%閾電壓的電刺激定義為L(zhǎng)L-CBS。9hRAP后測(cè)所有位點(diǎn)的有效不應(yīng)期（ERP）、ERP離散度及AF誘發(fā)窗口（WOV）。實(shí)驗(yàn)?zāi)┝羧⌒姆拷M織采用RT-PCR分析縫隙連接蛋白43（Cx43）的表達(dá)情況。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，LL-CBS組所有位點(diǎn)的ERP延長(zhǎng)，Cx43的DNA含量增加，ERP離散度和AF誘導(dǎo)性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 LL-CBS可抑制AF發(fā)生，這種保護(hù)機(jī)制與調(diào)控心房Cx43的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 低強(qiáng)度壓力感受器刺激；心房顫動(dòng)；縫隙連接蛋白43

[中圖分類號(hào)] R541.7+5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（c）-0026-04

Experiment study of treatment on atrial fibrillation with low-level carotid baroreceptor stimulation

QU Yuanyuan JIANG Hong▲

Department of Cardiology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To test the hypotheses that low-level carotid baroreceptor stimulation （LL-CBS） protects against atrial fibrillation （AF） induced by 9 hours rapid atrial pacing （9hRAP）. Methods Fourteen anesthetized beagles （7-9 kg） were divided into two groups： control group（6 cases） and LL-CBS group （8 cases）. Multi-electrode catheters were attached to the atria and pulmonary vein. All animals received 9hRAP， and animals in LL-CBS group received continuous LL-CBS at the same time， a voltage of stimulation setting at 80% below the threshold was defined as LL-CBS. The atrial effective refractory period （ERP）， ERP dispersion and the window of vulnerability （WOV） for AF were measured at all recording sites after 9hRAP. DNA of Atrial tissue was reserved at the end of the protocol and expression of Cx43 was determined by real time polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results Compared with control group， in LL-CBS group， ERP in all sites lengthened， DNA of Cx43 increased， ERP dispersion and AF inducibility decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion LL-CBS can suppress AF， the protective effects of LL-CBS may be due to its regulation of atrial Cx43 expression.

[Key words] Low-level carotid baroreceptor stimulation； Atrial fibrillation； Connexin 43

心房顫動(dòng)（AF）是最常見(jiàn)的快速性心律失常[1]。AF的發(fā)病率和死亡率日漸升高，成為當(dāng)今社會(huì)一項(xiàng)嚴(yán)重危害健康的疾病[2]。自主神經(jīng)在AF的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用[3]。調(diào)節(jié)自主神經(jīng)功能可能有助于控制AF的發(fā)生[4]。目前普遍認(rèn)為降低交感活性，增加迷走張力，有抗房性心律失常作用[5]。

低強(qiáng)度電刺激頸動(dòng)脈竇壓力感受器（LL-CBS）可以提高AF的誘發(fā)閾值[6]。心房細(xì)胞膜上的縫隙連接主要由連接蛋白（Cx）構(gòu)成，其中以Cx43為主。該蛋白表達(dá)或分布異常在AF發(fā)生中發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，AF動(dòng)物和AF患者心房Cx43表達(dá)下降[7]。本研究將采用經(jīng)典的AF模型來(lái)探索LL-CBS對(duì)AF的調(diào)控是否與Cx43相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物準(zhǔn)備

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供。14只健康成年比格犬（體重7～9 kg，合格證號(hào)：No.4200020000021），戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉。氣管插管接呼吸機(jī)（MAO01746，Harvard，美國(guó)），室內(nèi)空氣持續(xù)正壓通氣，設(shè)定潮氣量500 mL/min，呼吸頻率20次/min。分離一側(cè)股動(dòng)靜脈，并建立動(dòng)靜脈通道，股動(dòng)脈連接壓力換能器監(jiān)測(cè)血壓。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，靜脈輸生理鹽水（50～100 mL/h）以補(bǔ)充手術(shù)創(chuàng)口及鞘管流失的液體。每小時(shí)股靜脈追加戊巴比妥鈉2 mg/kg。為維持正常體溫，于犬下方放置一電熱板，維持體內(nèi)溫度在（37.0±0.5）℃。皮下針刺電極持續(xù)監(jiān)測(cè)體表心電圖、心率。經(jīng)第四肋間隙行雙側(cè)開(kāi)胸術(shù)，剪開(kāi)心包，將多電極導(dǎo)管縫于左右心房及肺靜脈處，包括左心房（LA），左心耳（LAA），左上肺靜脈（LSPV），左下肺靜脈（LIPV），右心房（RA），右心耳（RAA），右上肺靜脈（RSPV），右下肺靜脈（RIPV）。電極另一端連接神經(jīng)活性記錄儀。所有電生理信號(hào)與血壓信號(hào)均接入多導(dǎo)聯(lián)生理記錄儀（2000B，四川錦江）。

1.2 LL-CBS和實(shí)驗(yàn)分組

頸右側(cè)作縱向切口，暴露頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈的分叉處并與周圍組織分離。將一枚特制的Ag-AgCl刺激電極纏繞于頸動(dòng)脈竇外壁，電極另一端連與脈沖發(fā)生裝置（SEN-7013，Nihon Kohden，東京，日本）。進(jìn)行3～4次電刺激，每次持續(xù)3～5 min，若每次電刺激均能引起血壓和心率明顯降低，證實(shí)電極纏繞在正確部位。停止電刺激15 min后，血壓和心率通常可恢復(fù)至刺激前水平，則進(jìn)行下一次刺激。將能使血壓降低10%的電壓視為閾值。選擇80%的閾電壓進(jìn)行LL-CBS，每隔30 min進(jìn)行閾電壓校正。脈沖轉(zhuǎn)換器按以下參數(shù)設(shè)定：2.4～4.8 V，50 Hz，0.5 ms脈寬。

14只犬分為對(duì)照組（n=6）和LL-CBS組（n=8）。對(duì)照組行9小時(shí)快速心房起搏（9hRAP），LL-CBS組在快速起搏同時(shí)進(jìn)行CBS。

1.3建造AF模型

行9hRAP：按照Yu等[8]的實(shí)驗(yàn)方法，左側(cè)第四肋間隙開(kāi)胸暴露心臟后，將一刺激電極縫于左心耳處，刺激電極尾線連接Grass刺激儀（Grass-S88，Astro-Med，West Warwich RI），測(cè)定起搏閾值，以2倍起搏閾值的強(qiáng)度進(jìn)行快速心房起搏，起搏的頻率為20 Hz（1200 次/min），脈寬為0.1 ms，時(shí)間為9 h。在每小時(shí)末，重新測(cè)定起搏閾值以保證始終以2倍起搏閾值的強(qiáng)度起搏。

1.4 檢測(cè)電生理指標(biāo)

對(duì)縫制的8個(gè)位點(diǎn)分別進(jìn)行測(cè)量。采用S1S2法測(cè)定有效不應(yīng)期（ERP），先給予8個(gè)周期恒定的基數(shù)刺激（S1-S1 = 330 ms）后，給予一個(gè)期前刺激S2，S1-S2間期由150 ms開(kāi)始，每次縮短10 ms，若遇到不應(yīng)期，每減少1 ms。刺激電壓選用10倍刺激閾值。記錄到所有位點(diǎn)的變異系數(shù)即為ERP離散度，即標(biāo)準(zhǔn)差與均數(shù)之商。將誘發(fā)窗口（WOV）用于定量測(cè)量AF的誘發(fā)性。測(cè)量ERP時(shí)，在數(shù)次誘發(fā)出的AF中，最長(zhǎng)和最短的S1-S2間期即為WOV。ΣWOV是所有位點(diǎn)WOV之和。ΣWOV越大，AF越容易誘發(fā)。分別在刺激前及9hRAP后測(cè)得上述各指標(biāo)。

1.5 Cx43定量分析

從左右心房多位點(diǎn)獲取心房組織，提取細(xì)胞RNA并用DNA酶處理，用凝膠電泳對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析[9]。Cx43 RNA雙向引物由上海泛亞生物技術(shù)公司提供。Cx43上游引物：5'-AGA AAG AGG AGG AGC TCA AAG TTG-3，下游引物：5'-TTC AAT CTG CTT CAA GTG CAT GT-3'。用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Biosystems）檢測(cè)熒光信號(hào)。該實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化的PCR方案：PCR初期將混合物置于95℃溫浴2 min，使之變性，隨后進(jìn)行40次PCR循環(huán)，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s。按2-ΔΔCT計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量[10]，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 右側(cè)LL-CBS對(duì)ERP的影響

在基礎(chǔ)狀態(tài)，兩組各部位ERP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）（表1）。實(shí)驗(yàn)9 h后，LL-CBS組動(dòng)物心房8個(gè)位點(diǎn)ERP值與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（表2）。

2.2 右側(cè)LL-CBS對(duì)ERP離散度的影響

在基礎(chǔ)狀態(tài)，兩組ERP離散度[（0.04±0.02）比（0.05±0.03）ms]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。對(duì)LL-CBS組動(dòng)物進(jìn)行起搏及電刺激后，9 h末ERP離散度為（0.06±0.03）ms，對(duì)照組在進(jìn)行9hRAP后，ERP離散度為（0.16±0.05）ms，對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組比較，*P < 0.05；LL-CBS：低強(qiáng)度電刺激頸動(dòng)脈竇壓力感受器

圖1 9小時(shí)快速心房起搏后兩組有效不應(yīng)期離散度

2.3 右側(cè)LL-CBS對(duì)ΣWOV的影響

在基礎(chǔ)狀態(tài)，兩組ΣWOV間[（25±6）比（22±8）ms]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。對(duì)照組行9hRAP后，ΣWOV為（163±40）ms，對(duì)LL-CBS組動(dòng)物進(jìn)行起搏及電刺激后，9 h末ΣWOV為（42±5）ms，LL-CBS組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），AF誘導(dǎo)性降低。見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組比較，*P < 0.05；LL-CBS：低強(qiáng)度電刺激頸動(dòng)脈竇壓力感受器；WOV：誘發(fā)窗口

圖2 9小時(shí)快速心房起搏后兩組ΣWOV

2.4 右側(cè)LL-CBS對(duì)Cx4基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，LL-CBS組Cx43相對(duì)mRNA水平顯著增高（0.13±0.05比0.25±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要提出，LL-CBS阻止心房細(xì)胞Cx43丟失，從而降低AF誘導(dǎo)性。右側(cè)LL-CBS延長(zhǎng)心房ERP，降低AF誘導(dǎo)性，同時(shí)維持Cx43在正常表達(dá)水平，穩(wěn)定了心房電生理活動(dòng)。

壓力感受器位于心臟和各大血管中，可以同時(shí)調(diào)節(jié)交感張力和迷走張力[11]。頸動(dòng)脈壓力反射主要產(chǎn)自于頸動(dòng)脈竇中的壓力感受器，該感受器可探測(cè)局部血壓[12]。頸動(dòng)脈壓力反射通過(guò)調(diào)節(jié)交感張力，在調(diào)控血壓中發(fā)揮重要作用。在針對(duì)難治性高血壓患者亞組的研究中發(fā)現(xiàn)，頸動(dòng)脈竇壓力感受器刺激（CBS）使交感活動(dòng)受到抑制，并能增加迷走神經(jīng)活性，從而抑制全身交感神經(jīng)[13]。CBS已被用于治療難治性高血壓和慢性心衰[14-15]，其機(jī)制可能是調(diào)控自主神經(jīng)活動(dòng)。而自主神經(jīng)功能失調(diào)是AF發(fā)生的潛在機(jī)制，因此筆者推測(cè)，CBS可能具有抗AF的作用。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定使血壓降低10%的刺激為閾刺激，80%的閾刺激即為L(zhǎng)L-CBS。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，LL-CBS可以在RAP的AF模型中抑制心房電重構(gòu)和AF的發(fā)生，從而證實(shí)了這一推測(cè)。CBS將信號(hào)傳至背部脊髓，在腹外側(cè)脊髓發(fā)生信號(hào)的轉(zhuǎn)換和處理，并傳出至心臟[13]。高強(qiáng)度的CBS顯著增加AF誘導(dǎo)性[16]，而低強(qiáng)度的CBS可抑制AF的誘發(fā)[12]。

心房縫隙連接蛋白主要為Cx43。Cx43的表達(dá)和分布發(fā)生改變可嚴(yán)重影響電偶聯(lián)和電刺激的傳播。電傳導(dǎo)紊亂使得AF易于發(fā)生。連接蛋白表達(dá)降低，心房電傳遞速度減慢，促進(jìn)微小電折返的發(fā)生，這是持續(xù)性AF發(fā)生的關(guān)鍵因素[17]。已有學(xué)者進(jìn)行相關(guān)基因研究，連接蛋白基因突變或基因刪除，連接蛋白表達(dá)低于正常水平，心房肌傳導(dǎo)速度減慢，AF易誘發(fā)[18]。另有實(shí)驗(yàn)，在AF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上進(jìn)行Cx43基因轉(zhuǎn)移，該措施顯著加快心房傳遞速度，有效終止了AF發(fā)作[19]。本研究中，LL-CBS可抑制急性犬實(shí)驗(yàn)中RAP誘導(dǎo)的AF，延長(zhǎng)心房ERP并保護(hù)心房細(xì)胞Cx43。LL-CBS抑制Cx丟失可能與多種機(jī)制相關(guān)：首先，Cx43是一種短壽蛋白，在心臟中其半衰期僅數(shù)小時(shí)[20]，LL-CBS可能抑制Cx降解從而延長(zhǎng)其半衰期。其次，已有研究報(bào)道，NO經(jīng)cGNP抑制PDE3活性，抑制Cx基因的表達(dá)[21]。LL-CBS可能通過(guò)激活NO合成酶，增加NO釋放，使得Cx表達(dá)上調(diào)。第三，只有磷酸化的Cx才具有活性[22]，LL-CBS能激活蛋白激酶引起Cx發(fā)生磷酸化。

本研究LL-CBS組中，LL-CBS能顯著抑制9hRAP引起的ERP縮短、ERP離散度延長(zhǎng)和ΣWOV增加，證實(shí)LL-CBS能有效抑制心房急性電重構(gòu)，與Liao等[6]的研究一致。但本實(shí)驗(yàn)只研究了LL-CBS的短期效應(yīng)（9 h），其長(zhǎng)期效應(yīng)有待建立慢性AF模型進(jìn)一步研究。已有研究表明，LL-CBS通過(guò)抑制心臟神經(jīng)節(jié)叢（GP）活性，降低AF誘導(dǎo)性[6]。本實(shí)驗(yàn)中，LL-CBS抑制心房細(xì)胞膜Cx43丟失與GP活性降低關(guān)系如何，低強(qiáng)度電刺激左側(cè)頸動(dòng)脈壓力感受器是否產(chǎn)生同樣功效，還有待深入研究。

刺激自主神經(jīng)系統(tǒng)可引起心房電生理發(fā)生顯著變化，并能誘發(fā)AF，本研究認(rèn)為神經(jīng)調(diào)節(jié)是控制AF的一項(xiàng)有效手段，且部分神經(jīng)干預(yù)措施已用于臨床使用[3]。LL-CBS可抑制AF發(fā)生，對(duì)血壓無(wú)明顯影響。對(duì)于CBS與AF關(guān)系的深入研究，有助于CBS在臨床運(yùn)用中的推廣。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Kirchhof P，Bax J，Blomstrom-Lundquist C，et al. Early and comprehensive management of atrial fibrillation： executive summary of the proceedings from the 2nd AFNET-EHRA consensus conference “research perspectives in AF” [J]. Eur Heart J，2009，30（24）：2969-77c.

[2] Male S，Scherlag BJ. Role of neural modulation in the pathophysiology of atrial fibrillation [J]. Indian J Med Res，2014，139（4）：512-522.

[3] Ahmed H，Miller MA，Dukkipati SR，et al. Adjunctive renal sympathetic denervation to modify hypertension as upstream therapy in the treatment of atrial fibrillation （H-FIB） study：clinical background and study design [J]. J Cardiovasc Electrophysiol，2013，24（5）：503-509.

[4] Arora R. Recent insights into the role of the autonomic nervous system in the creation of substrate for atrial fibrillation： implications for therapies targeting the atrial autonomic nervous system [J]. Circ Arrhythm Electrophysiol，2012，5（4）：850-859.

[5] Iwasaki YK，Nishida K，Kato T，et al. Atrial fibrillation pathophysiology：implications for management [J]. Circulation，2011，124（20）：2264-2274.

[6] Liao K，Yu L，Zhou X，et al. Low-Level Baroreceptor stimulation suppresses atrial fibrillation by inhibiting ganglionated plexus activity [J]. Canadian Journal of Cardiology，2015，31（6）：767-774.

[7] Polontchouk L，Haefliger JA，Ebelt B，et al. Effects of chronic atrial fibrillation on gap junction distribution in human and rat atria [J]. J Am Coll Cardiol，2001，38（3）：883-891.

[8] Yu L，Scherlag BJ，Sha Y，et al. Interactions between atrial electrical remodeling and autonomic remodeling：how to break the vicious cycle [J]. Heart Rhythm，2012，9（5）：804-809.

[9] Burstein B，Qi XY，Yeh YH，et al. Atrial cardiomyocyte tachycardia alters cardiac fibroblast function：a novel consideration in atrial remodeling [J]. Cardiovasc Res，2007，76（3）：442-452。

[10] Zhang W，Ma X，Zhong M，et al. Role of the calpain system in pulmonary vein connexin remodeling in dogs with atrial fibrillation [J]. Cardiology，2009，112（1）：22-30.

[11] Kapa S，Venkatachalam KL，Asirvatham SJ. The autonomic nervous system in cardiac electrophysiology： an elegant interaction and emerging concepts [J]. Cardiol Rev，2010，18（6）：275-284.

[12] Marshall JM. Peripheral chemoreceptors and cardiovascular regulation [J]. Physiol Rev，1994，74（3）：543-594.

[13] Heusser K，Tank J，Engeli S，et al. Carotid baroreceptor stimulation，sympathetic activity，baroreflex function，and blood pressure in hypertensive patients [J]. Hypertension，2010，55（3）：619-626.

[14] Bakris GL，Nadim MK，Haller H，et al. Baroreflex activation therapy provides durable benefit in patients with resistant hypertension：results of long-term follow-up in the Rheos Pivotal Trial [J]. J Am Soc Hypertens，2012，6（2）：152-158.

[15] Gronda E，Seravalle G，Brambilla G，et al. Chronic baroreflex activation effects on sympathetic nerve traffic，baroreflex function，and cardiac haemodynamics in heart failure：a proof-of-concept study [J]. Eur J Heart Fail，2014，16（9）：977-983.

[16] Linz D，Mahfoud F，Schotten U，et al. Effects of electrical stimulation of carotid baroreflex and renal denervation on atrial electrophysiology [J]. J Cardiovasc Electrophysiol，2013，24（9）：1028-1033.

[17] van der Velden HM，Jongsma HJ. Cardiac gap junctions and connexins：their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets [J]. Cardiovasc Res，2002，54（2）：270-279.

[18] Gollob MH，Jones DL，Krahn AD，et al. Somatic mutations in the connexin 40 gene （GJA5） in atrial fibrillation [J]. N Engl J Med，2006，354（25）：2677-2688.

[19] Igarashi T，F(xiàn)inet JE，Takeuchi A，et al. Connexin gene transfer preserves conduction velocity and prevents atrial fibrillation [J]. Circulation，2012，125（2）：216-225.

[20] Darrow BJ，Laing JG，Lampe PD，et al. Expression of multiple connexins in cultured neonatal rat ventricular myocytes [J]. Circ Res，1995，76（3）：381-387.

[21] Yao J，Hiramatsu N，Zhu Y，et al. Nitric oxide-mediated regulation of connexin43 expression and gap junctional intercellular communication in mesangial cells [J]. J Am Soc Nephrol，2005，16（1）：58-67.

[22] Ando M，Katare RG，Kakinuma Y，et al. Efferent vagal nerve stimulation protects heart against ischemia-inducedarrhythmias by preserving connexin43 protein [J]. Circulation，2005，112（2）：164-170.

（收稿日期：2015-10-30 本文編輯：蘇 暢）