血管鈣化及其平滑肌細胞表型轉化的調節機制

常曉丹 李麗華 張寶紅

[摘要] 血管鈣化常見于高血壓、糖尿病血管病變、動脈粥樣硬化、慢性腎病、衰老等傳統的老年病或慢性病，此外還可見于小兒，如新生兒期血管鈣化、肺動脈高壓、尿毒癥性小動脈鈣化等，均可危及生命。最近研究發現，血管鈣化是一種多因素介導、可逆的、主動的調節過程，涉及多種細胞因子及信號通路，血管鈣化的本質是血管平滑肌細胞向成骨細胞樣表型轉化，導致血管壁增厚、管腔狹窄、血管硬化重塑，因此血管鈣化及其平滑肌細胞表型轉化相關的信號轉導調節機制成為這一領域的重大研究課題。

[關鍵詞] 血管鈣化；血管平滑肌細胞；表型轉化；信號通路

[中圖分類號] R543.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0030-04

Regulatory mechanism of vascular calcification and its smooth muscle cell phenotype transformation

CHANG Xiaodan1，2 LI Lihua1 ZHANG Baohong3

1.Department of Neonatology， Bayi Children's Hospital Affiliated to Clinical Medical College in Beijing Military General Hospital of Southern Medical University， Beijing 100700， China； 2.Department of Neonatology， the Second Central Hospital of Baoding City， Hebei Province， Baoding 072750， China； 3.Department of Pediatrics， the Hospital of Tsinghua University， Beijing 100084， China

[Abstract] Vascular calcification is common in hypertension， atherosclerosis， diabetes， chronic kidney disease， aging， etc. Not only found in these elderly or chronic diseases， but also in children， such as neonatal vascular calcification， pulmonary hypertension， uremic small artery calcification， can endanger life. Recent studies have found that vascular calcification is a multi factor， reversible and active regulation process. It involves many kinds of cytokines and signaling pathways. The essence of vascular calcification is vascular smooth muscle cells to differentiate into osteoblast like phenotype， resulting in vascular wall thickening， lumen stenosis and vascular remodeling. Therefore， it is important to study the mechanism of vascular calcification and the modulation of the signal transduction pathway related to the phenotype of smooth muscle cells.

[Key words] Vascular calcification； Vascular smooth muscle cells； Cell phenotype transformation； Signaling pathway

血管鈣化是一種類似于骨和軟骨生理性礦化的主動的、可逆的、多種細胞因子介導的調節過程[1]。血管鈣化可以根據位置分為四種主要類型：動脈粥樣硬化內膜鈣化、動脈中層鈣化、心臟瓣膜鈣化、鈣化性尿毒癥性小動脈病[2]。血管鈣化的關鍵是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨細胞樣表型轉化，涉及細胞凋亡、氧化應激、代謝異常、信號通路等多種復雜的病理生理過程，而目前血管鈣化及其平滑肌細胞表型轉化相關的信號轉導通路調節機制尚未完全明確，現將一些可能的機制綜述如下：

1 血管鈣化的起始環節

血管鈣化過程中，血管壁礦化防御機制被耗竭，血管平滑肌細胞丟失原有表型而獲得成骨表型，先后釋放基質小泡和凋亡小體，為鈣磷結晶提供合適的核心微環境。基質小泡（matfix vesicles，MVS）是細胞外的一種100～700 nm大小的膜包裹結構，富含多種磷脂和蛋白，鈣磷脂結合蛋白通過激活鈣通道活性，導致基質小泡內鈣離子積聚，磷脂類以磷脂酰絲氨酸為主，具有富集鈣離子和磷酸鹽形成高度難溶的羥基磷灰石晶體，該晶體通過基質小泡膜的降解釋放進入細胞外基質，與膠原蛋白連接，繼而在細胞外環境的調節下不斷生長形成礦化結節，因此基質小泡是鈣化過程的初始礦化位點[3]。研究表明基質小泡來源于VSMCs衍生的凋亡小體，在受損的或死亡的VSMCs釋放的基質小泡中含有羥基磷灰石單晶體，且在體外鈣化培養的人主動脈平滑肌細胞（SMC），其鈣化結節中心細胞在鈣化早期就表現出核固縮、核碎裂等典型的凋亡特征，提示細胞凋亡和MVS的形成是血管鈣化的始動環節[4]。

2 血管鈣化與細胞因子

血管細胞外基質是一類由膠原、蛋白聚糖及糖蛋白等大分子物質組成的動態網狀結構，分為基膜（BMs）和間隙結締組織（ICT）兩大類，是維持血管壁結構完整和功能正常的必要保證，同時也是各種細胞因子的儲存庫。BMs主要包括Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和蛋白聚糖等，ICT則主要包括Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖粘連蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖和氨基聚糖等，此外還包括多種骨分化相關蛋白，如骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）等[5-7]。

膠原是構成細胞外基質的骨架，血管平滑肌細胞合成膠原的能力是血管內穩態的重要組成部分，主要分泌Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原蛋白，鈣化血管也可以高表達Ⅱ型膠原。Blackstock等[8]發現，胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）可增加ApoE基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊膠原含量，而斑塊中的膠原含量是斑塊穩定性的一個重要標志，進而研究在鈣化SMC，IGF-1顯著增加larp6的表達，從而增加Ⅰ型膠原合成和膠原細胞外積累，促進纖維成熟，以維持動脈粥樣硬化斑塊內纖維帽的結構完整性。血管壁內存在一些維生素K依賴蛋白也是有效的鈣化抑制蛋白，如OCN又稱骨γ-羧基谷氨酸蛋白、基質Gla蛋白（matrix Gla protein，MGP）等，這些蛋白均含有特異性谷氨酸殘基，其共性是需在維生素K參與下經γ谷氨酸羧化酶催化產生γ-羧基谷氨酸發揮生物學效應[9]。OCN是由成骨細胞分泌的一種體內最豐富的特異性非膠原蛋白，其特異性谷氨酸殘基可結合鈣、磷和羥磷灰石，抑制骨中羥基磷灰石結晶的形成，OCN主要在血管細胞礦化形成期出現，因此被認為是血管平滑肌細胞向成骨細胞轉化的標志之一。Pal等[10]學者研究表明在OPG缺乏的小鼠主動脈鈣化模型以及具有間歇性跛行癥狀的主動脈鈣化患者，循環單核細胞表達成骨細胞標志物OCN的百分比均顯著下降，這表明骨髓來源的OCN陽性單核細胞在病變動脈分化為成骨細胞，促進血管鈣化。MGP廣泛分布于軟骨和血管壁，在維生素K的參與下其谷氨酸殘基羧化為活性形式，Gla與血清中游離鈣離子結合，抑制鈣鹽沉積，并與鈣化VSMCs產生的基質小泡及凋亡小體結合，抑制血管鈣化的始動環節。MGP基因敲除所致的MGP缺乏的小鼠，其VSMCs失去收縮表型標志分子α平滑肌肌動蛋白，而表型轉化特異性轉錄因子Osterix及Runx2的表達上調，堿性磷酸酶活性升高，骨橋蛋白表達增加[11]。OPG又稱護骨素或破骨細胞抑制因子，是由成骨細胞分泌的糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，OPG/RANK/RANKL途徑是近年來發現的在破骨細胞分化過程中的一個重要信號轉導通路，OPG可作為誘餌受體與核因子κB受體活化因子（RANK）競爭性結合其特異性配體RANKL，阻止RANK與RANKL之間的結合，從而抑制破骨細胞前體的分化和激活，降低成熟破骨細胞的活性，誘導破骨細胞凋亡，增加骨密度。Callegari等[12]研究顯示2/3的OPG基因敲除所致OPG缺乏小鼠在成熟之前即表現出嚴重的骨質疏松及主動脈和腎動脈中層的鈣化，同時在鈣化動脈還檢測到RANK及RANKL的表達增加。BMPs是誘導骨發生的主要活性因子，屬于轉化生長因子-β（TGF-β）超基因家族成員，目前體內外實驗均證實BMPs是具有誘導間充質細胞向骨組織方向分化的生長因子，其中BMP-2參與血管鈣化的作用最為重要。Sage等[13]在高磷誘導的小鼠血管平滑肌細胞鈣化模型，發現高磷培養基培養24 h顯著誘導BMP-2和OPN的表達，7 d后BMP-2的表達更顯著，且Osterix表達增加，但MGP的表達明顯下調。OPN是由骨基質細胞產生的骨特異性的、含有唾液酸的分泌型糖基化非膠原蛋白，含有保守的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD）序列的，從而發揮其特異性細胞黏附功能，例如OPN的RGD基序與破骨細胞表面的整合素αvβ3受體結合，其酸性結構域與細胞外基質的礦物質表面相互作用，酸化局部微環境，使礦物質溶解，抑制羥基磷灰石結晶的生長，實現抑制血管鈣化的作用[14]。

3 血管鈣化時細胞表型轉化的調節

根據細胞結構和功能的不同，VSMC分為收縮型（分化型）和合成型（未分化型或去分化型）兩種表型，在不同的生理和病理條件下，如血管損傷、機械牽張、生長因子的刺激，VSMCs可在收縮表型和合成型之間轉化，該過程稱為表型轉化，呈可逆狀態。正常血管中膜中的 VSMCs 以收縮型為主，是一種高分化的細胞，主要起維持血管形態以及收縮血管的作用，具有低增殖、低遷移、低蛋白分泌的特征；當發生動脈粥樣硬化等血管病變時，VSMCs去分化成為合成型細胞，收縮性能下降，表現出高增殖、高遷移、高蛋白分泌等特征[15]。

VSMC中存在含量豐富的蛋白α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，SMα-actin），在收縮型細胞中呈優勢表達，國內學者利用Nelin基因過表達和干擾慢病毒載體轉染VSMC細胞模型，發現VSMC向收縮表型轉化的早期SMα-actin的表達增加，說明SMα-actin是VSMC分化早期的特異性標志物[16]。SM22α（smooth muscle 22 alpha）作為一種重要的細胞骨架調節蛋白，其表達具有平滑肌組織特異性和細胞表型特異性，可作為一種肌動蛋白結合蛋白，促進肌動蛋白聚合形成應力纖維，參與細胞骨架重構和表型調節[17]，是收縮型VSMC的表達標志物之一。體外誘導VSMC由合成型逆轉為收縮型，SM22α轉錄活性明顯增高，伴隨VSMC細胞骨架結構由稀疏的網絡狀向致密的束狀重構，同時利用構建的反義SM22α表達載體轉染VSMC后，細胞收縮無力，骨架重構受阻，說明SM22α具有維持VSMC收縮表型的重要作用[18]。Runx2和Osterix是成骨細胞表型轉化最關鍵的特異性轉錄因子，高磷誘導Runx2的表達增加，伴隨著SMα肌動蛋白和SM22α損失[19]，人Runx2基因缺失將導致顱骨鎖骨發育不良綜合征，成纖維細胞生長因子（TGF）可通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑增強Runx2的活性，甲狀旁腺素（PTH）可能通過蛋白激酶（PKA/PKC）途徑活化Runx2，Nell-1則通過ERK1/2途徑磷酸化Runx2，進而促進小鼠顱蓋骨細胞分化[20]。Osterix是Runx2的下游基因，具有更多的選擇性作用于成骨細胞的形成和骨礦化，在Osterix敲除鼠中可以檢測到Runx2的表達，在成骨細胞分化早期，Runx2和Osterix協同誘導內源性ALP、OPN基因的表達[21]。

VSMC表型轉化過程受多條信號轉導途徑的調節，主要包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑、PI3K、環磷酸腺苷（CAMP）三個途徑。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一類廣泛存在于哺乳動物細胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2是經典的MAPK信號轉導途徑，細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）包括ERK1和ERK2，是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵，磷酸化激活的ERKl/2才具有生物學活性，介導細胞增殖與分化。Ding等[22]原代培養大鼠成骨細胞，在MAPK-ERK1/2高水平激活狀態下，成骨細胞表型轉化特異性基因Runx2、Ⅰ型膠原和ALP表達水平出現顯著的增加及促進增殖細胞核抗原（PCNA）的表達。Ge等[23]在轉基因COS7細胞，ERK1/2與P38/MAKP信號通路通過與 S301和S319磷酸化位點結合，協同刺激成骨細胞的基因Runx2磷酸化，導致細胞外基質Ⅰ型膠原、骨形態發生蛋白（BMP）的表達增加，而加入抑制劑UO126可抑制ERK磷酸化和Runx2活性，最終明確ERK1/2途徑調節成骨細胞表型轉化的基因表達。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，能被酪氨酸激酶受體家族（receptor tyrocine kinase，RTK）激活，AKT又稱蛋白激酶，是PI3K下游直接靶蛋白，RTK與其配體結合后引起胞質區域內酪氨酸殘基自身磷酸化，并招募含有PH結構域結合蛋白AKT到細胞膜表面，被激活的AKT通過對絲氨酸/蘇氨酸位點MAPK、ERK、mTor的磷酸化來調節成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和凋亡。Akt及其下游蛋白是骨形成和骨重建的關鍵調控因子，Akt基因敲除小鼠骨骼縮短、骨化延遲，Suzuki等[24]利用腫瘤壞死因子（TGF-β1）誘導成骨細胞MC3T3-E1表型分化，研究發現Akt活性明顯增加，成骨細胞分化特異性因子Osterix表達增加。cAMP信號通路又稱PKA系統（protein kinase A system，PKA），通過腺苷酸環化酶活性的變化調節靶細胞內第二信使CAMP水平，使下游靶蛋白磷酸化，維持VSMC收縮型和促進其分化。Qiu等[25]用慢病毒介導的shRNA干擾技術沉默人骨肉瘤MG-63細胞系PKD1基因，導致細胞增殖和成骨分化受阻，堿性磷酸酶活性降低，細胞內鈣沉積和Runx2、Osterix表達降低，而使用抑制劑H89降低cAMP和PKA的活性后，成骨細胞增殖、分化指標均有所恢復，這些研究結果表明cAMP/PKA信號通路在調節成骨細胞功能中發揮重要作用。

4 結語

血管平滑肌細胞是參與血管鈣化最重要的血管細胞成分，其增殖、遷移、凋亡以及向成骨細胞樣表型轉化涉及多種細胞因子及信號轉導通路的調節，基于上述理論基礎，血管鈣化相關抑制因子的研究將成為突破血管鈣化這一醫學難題的潛在靶點，而研究血管平滑肌細胞表型轉化的機制對臨床預防和逆轉血管鈣化的發病具有潛在的指導價值。

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（收稿日期：2015-11-23 本文編輯：張瑜杰）