藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞增殖及Gankyrin表達的影響

邱旭彬 曹杰 楊平

[摘要] 目的 觀察藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞增殖和Gankyrin表達的影響，探討其抑制人結腸癌生長增殖的作用機制。 方法 以1.0、2.0、4.0 μg/mL的藤黃酸作用體外培養的人結腸癌HCT116細胞，并設未予藤黃酸處理的對照組。處理12、24、36 h后，分別采用CCK-8法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞周期分布和細胞凋亡率，Western blot檢測Gankyrin蛋白水平的變化。 結果 藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞生長增殖具有抑制作用，且呈濃度和時間依賴性，相同濃度不同時間點的抑制率差異有統計學意義（P < 0.05），不同濃度相同時間點的抑制率差異有統計學意義（P < 0.05）。流式細胞儀結果提示，藤黃酸阻滯HCT116細胞于G2/M期，1.0、2.0、4.0 μg/mL的藤黃酸處理24 h后，處于G2/M期的細胞數量均較對照組明顯增加，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；HCT116細胞的凋亡率隨藤黃酸濃度增加而逐步上升，2.0、4.0 μg/mL的藤黃酸處理后HCT116細胞的凋亡率均高于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。用不同濃度的藤黃酸處理HCT116細胞24 h，Gankyrin蛋白水平隨藥物濃度的增加而下降（P < 0.05）。 結論 藤黃酸能夠抑制人結腸癌HCT116細胞的生長增殖，誘導HCT116細胞阻滯于G2/M期，使Gankyrin的表達水平下降，其誘導腫瘤細胞凋亡的作用可能與抑制Gankyrin的表達相關。

[關鍵詞] 人結腸癌；HCT116細胞；藤黃酸；Gankyrin

[中圖分類號] R735.35 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（b）-0004-04

Effect of gambogic acid on human colon cancer HCT116 cell proliferation and expression of Gankyrin

QIU Xubin CAO Jie▲ YANG Ping ZENG Shanqi WANG Chengxing WU Qianlong CHEN Huacui

Area Two of Department of Gastrointestinal Surgery， Affiliated Guangzhou First Municipal People's Hospital， Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510180， China

[Abstract] Objective To observe the effect of gambogic acid on human colon cancer HCT116 cell proliferation and expression of Gankyrin， and to discuss the suppression mechanism. Methods 1.0， 2.0， 4.0 μg/mL of gambogic acid was used in human colon cancer HCT116 cells which were cultured in vitro， and the control group that without gambogic acid was set. 12， 24， 36 hours after gambogic acid treatment， the cell proliferation activity was tested by methyl thiazolyl tetrazolium （CCK-8） assay， the cell-cycle kinetics and cell apoptosis were tested by flow cytometry （FCM）， and the change of expression of Gankyrin protein were tested by Western blot respectively. Results The proliferation of HCT116 cells was suppressed by gambogic acid in concentration and time dependent manner， inhibition rate of the same concentration in different time points had statistically significant difference （P < 0.05）， and the inhibition rate of the HCT116 cells with different concentration at the same time points had statistically significant difference （P < 0.05）. Results of FCM showed that， the HCT116 cell was stopped at G2/M period， 24 h after 1.0， 2.0， 4.0 μg/mL gambogic acid treatment， the number of cells in G2/M period increased significantly， compared with the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The apoptosis of HCT116 cell rose with the increase of gambogic acid concentration， after 2.0， 4.0 μg/mL gambogic acid treatment， apoptosis rate of HCT116 cells was higher than that of the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. 24 hours after different concentration of gambogic acid treatment， the level of Gankyrin protein decreased as the concentration increased （P < 0.05）. Conclusion Gambogic acid can significantly inhibit the proliferation of human colon cancer HCT116 cell， and induces the HCT116 cell stopped at G2/M period， decreases the level of Gankyrin expression， its effect of inducing apoptosis on tumor cells may related to the suppression of Gankyrin expression.

[Key words] Colon cancer； HCT116 cells； Gambogic acid； Gankyrin

結腸癌是一種發病率較高的消化道惡性腫瘤。近年來隨著經濟條件改善，人民生活水平逐漸提高，生活方式、飲食習慣及外部環境因素也隨之發生了改變，我國結腸癌發病率呈4.2%的增長趨勢逐年增長，當前已高居我國消化道腫瘤發病率的第2位，發病及病死人數已超過美國[1]。藤黃酸（gambogic acid，GA）是從中藥藤黃中提取的主要活性成分，為一種低毒性廣譜抗癌藥。本課題組前期的研究表明，其對消化道腫瘤療效顯著，尤其對結直腸癌細胞具有良好的抑制作用[2]。本研究觀察不同濃度的藤黃酸對體外培養的人結腸癌HCT116細胞作用情況，探討藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞的作用并檢測其對Gankyrin蛋白表達的影響，分析中藥成份藤黃酸誘導人結腸癌HCT116細胞發生凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌HCT116細胞由美國ATCC公司引進，由南京凱基生物科技發展有限公司提供；藤黃酸粉劑，純度為99%，購自美國Sigma公司，-20℃保存；細胞培養相關試劑均購自Gibco公司；CCK-8試劑盒購自上海生物工程有限公司；SDS-PAGE試劑盒購自碧云天生物技術研究所；兔抗人Gankyrin多克隆抗體由美國Abcam公司引進。

1.2 方法

1.2.1 結腸癌細胞培養 將人結腸癌HCT116細胞置于含10%胎牛血清及雙抗（100 U/mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素）的Gibco 1640培養基中，37℃，含5%CO2孵箱中培養。

1.2.2 采用CCK-8法檢測藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞生長增殖抑制作用 取對數生長期的人結腸癌HCT116細胞接種于96孔培養板培養，細胞定量每孔2×104個細胞，培養24 h后撤出所有培養液，每孔分別加入體積200 μL的藤黃酸，再次添加新鮮培養基，并使其最終的濃度分別為0、1.0、2.0、4.0 μg/mL（0 μg/mL為對照組，其他各濃度為實驗組）。將各組細胞分別繼續培養12、24、36 h后，于每孔中加入體積20 μL的CCK-8檢測液體繼續在原培養環境中孵育1 h后再小心吸棄各個孔內的培養上清液，用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。根據各OD值計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100，實驗重復3次，取其均值。

1.2.3 采用流式細胞檢測技術檢測細胞增殖情況 將人結腸癌HCT116細胞分別接種于6孔培養板中，24 h后將含藤黃酸的濃度分別為1.0、2.0、4.0 μg/mL的新鮮Gibco 1640培養液加入培養板，把0 μg/mL設為對照組，培養24 h后按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒方法處理細胞，作流式細胞相關分析，將激發波長設為488 nm，并分析細胞周期的分布以及凋亡的情況。

1.2.4 采用Western blot檢測Gankyrin蛋白表達水平 藤黃酸0、1.0、2.0、4.0 μg/mL處理24 h的HCT116細胞，細胞定量2×106，分別按每1×106添加200 μL蛋白裂解液提取蛋白質后，Bradford法分別測定蛋白含量。配用12%分離膠，5%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，于每孔中加入蛋白質50 pg，以100 V的恒壓電泳至膠底部分離，再轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入經1∶500體積稀釋的兔抗人Gankyrin多克隆抗體，在搖床上勻速振搖2 h后，用PBST反復洗滌3次，每次持續15 min。然后再加人經1∶400體積稀釋的兔抗羊IgG-HRP，在搖床上勻速振搖2 h，用PBST反復洗滌3次，最后用ECL試劑對硝酸纖維素膜進行顯色，暗室曝光，拍照，灰度分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗或ANOVA方差分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞生長增殖的抑制作用

不同濃度的藤黃酸對HCT116細胞呈現出不同的抑制作用，當藤黃酸濃度為0 μg/mL時，其對HCT116細胞基本沒有抑制作用，處理12、24、36 h后，抑制率分別為（0.71±1.21）、（0.89±1.01）、（1.07±0.97）%；當藤黃酸濃度分別為1.0、2.0、4.0 μg/mL時，處理12、24、36 h后抑制率逐漸升高，且相同濃度不同時間點的抑制率差異有統計學意義（P < 0.05），不同濃度相同時間點的抑制率差異有統計學意義（P < 0.05）。提示藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞的生長和增殖具有一定的抑制作用，且抑制率隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而逐漸升高，抑制作用呈濃度及時間依賴性。見表1。

表1 不用濃度藤黃酸作用不同時間時對人結腸癌HCT116細胞

生長增殖的抑制率比較（%，x±s，n=3）

2.2 藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞周期的影響

藤黃酸作用人結腸癌HCT116細胞后，可顯著改變其細胞周期中各期細胞的構成。經1.0 μg/mL的藤黃酸處理24 h后，處于G2/M期的細胞數量較對照組增加，差異有統計學意義（P < 0.05），提示人結腸癌HCT116細胞已被阻斷于G2/M期。此時細胞凋亡水平為（0.81±0.09）%，與對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；濃度為2.0 μg/mL時，G2/M期細胞數量較對照組明顯增加，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；當藤黃酸劑量濃度增至4.0 μg/mL時，有50%以上的HCT116細胞被阻斷于G2/M期，而處于G0/G1期的細胞數量則相應減少，與對照組比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。HCT116細胞的凋亡峰在藥物濃度4.0 μg/mL時為（14.07±1.21）%，且2.0及4.0 μg/mL的藤黃酸與對照組比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），提示藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞的生長增殖具有一定的抑制作用，結果呈濃度依賴性。見表2。

表2 經梯度濃度藤黃酸作用24 h后HCT116細胞的周期變化

和凋亡水平（%，x±s，n=3）

注：與0 μg/mL同期比較，*P < 0.05，#P < 0.01

2.3 藤黃酸作用人結腸癌HCT116細胞后Gankyrin表達量的變化

分別用0、1.0、2.0、4.0 μg/mL藤黃酸處理HCT116細胞24 h，各組培養結束后Western blot檢測各組細胞Gankyrin蛋白表達水平，以GAPDH為內參，應用IPP測量各組平均灰度值。在相對分子量26kD處可見清晰Gankyrin蛋白條帶，當藤黃酸濃度為0、1.0、2.0、4.0 μg/mL時其灰度值分別為（723.00±3.61）、（597.00±2.14）、（392.00±1.54）、（101.00±0.74），差異有統計學差異（P < 0.05）。提示經藤黃酸作用后Gankyrin蛋白的表達受到抑制，且隨著藤黃酸濃度的升高，Gankyrin蛋白表達逐漸減少。見圖1。

1：0 μg/mL；2：1.0 μg/mL；3：2.0 μg/mL；4：4.0 μg/mL；GAPDH：內參

圖1 不同濃度藤黃酸處理后HCT116細胞中Gankyrin蛋白表達水平

3 討論

結直腸癌是目前國內外最常見的惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升趨勢，目前位居全球惡性腫瘤第3位[3-4]。其在經濟發達國家發生率較高，是西方國家第2位高發的惡性腫瘤，美國結直腸癌的病死率位居所有癌癥死因的第3位[5]。根據我國納入腫瘤發生率監控的5個大城市近10年結直腸癌的發生率變化，各地區結直腸癌的發生率均有不同程度的上升，其中上海和北京上升最快，廣州地區發病率已躍升至全國第3位[6]。而結直腸癌在廣州地區的發病率已經高居所有腫瘤的第2位，僅次于肺癌，發病情況不容樂觀[7]。目前對于結腸癌的主要治療手段包括手術、化療、放療及三者的聯合治療等，現階段藥物治療雖然可以降低患者的復發率，延長患者的生命，但是化療藥物的毒副作用使其應用受到了限制，且個別化療效果欠佳。開發研究新的高效低毒藥物，增強化療藥物特異性和敏感性是當前化療領域的研究熱點。

藤黃是藤黃科植物藤黃樹干經切傷后所分泌的干燥樹脂[8]。而藤黃酸是植物中藥藤黃所分泌的干燥樹脂的主要成分。中醫藥學記載，藤黃，酸、澀、涼、有大毒[9]。但藤黃具有抗炎、止血、抑菌、抗病毒等多種功效，常用于治療跌打損傷、膿腫、癤癰及各種體蘚[10]。藤黃酸分子式為C38H44O8，相對分子量為628.76，為橙黃色無定型粉末，具有光學活性[11]?，F代研究表明藤黃酸具有潛在的抗腫瘤效應，能夠抑制多種腫瘤的生長、侵襲轉移及促進腫瘤細胞的凋亡等功能。藤黃酸在有效劑量范圍內的毒副作用相對來說比較小，有非常高的腫瘤細胞抑制選擇性，能夠選擇性地殺死癌細胞，而對正常動物機體的免疫功能和骨髓造血系統影響卻非常小，相對現階段臨床常規化療藥物優勢明顯[12]。

Gankyrin作為近年發現的一個癌相關蛋白，與腫瘤細胞的細胞周期乃至凋亡存在明顯相關性。它作為一個重要組成部分，參與26S蛋白酶體的構成。Gankyrin不僅參加調控P53及Rb通路，而且其與相關26S蛋白酶體參與DNA雙鏈的修復過程，具有抗凋亡作用。Gankyrin可與MDM2結合，促使p53泛素化降解，也可作用于CDK4蛋白，促使Rb磷酸化降解。Gankyrin曾被報道可誘導NIH3T3細胞具有非依賴支持生長的功能，且使細胞瘤化[13-15]。近年來研究報道以及生物信息學數據庫分析結果顯示，Gankyrin與肝癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、結直腸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤相關[16-21]。

本研究結果提示藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞有明顯的增殖抑制作用，當藤黃酸濃度≥1.0 μg/mL時，其對HCT116細胞具有明顯抑制作用，且隨著時間的延長，其抑制率逐漸升高，結果呈現濃度及時間依賴性。

流式細胞儀檢測藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞的G2/M期具有明顯的阻滯作用，提示藤黃酸可以抑制HCT116細胞的DNA合成，從而阻止細胞周期中有絲分裂的關鍵進程，且主要使細胞停滯于細胞周期的G2/M期。而細胞周期的監測點和這種細胞周期的停滯存在一定關系，當細胞受損后于對應的檢測點進行相關DNA修復時無法對受損DNA進行功能修復，細胞就會程序性死亡[22]。流式細胞檢測結果提示除細胞周期阻滯外，藤黃酸還促進人結腸癌HCT116細胞的凋亡，本研究結果提示，在1.0 μg/m濃度狀態下，HCT116細胞的凋亡情況與對照組比較，差異無統計學意義，當濃度為2.0、4.0 μg/mL時，HCT116細胞凋亡率顯著上升，但總體凋亡率較周期阻滯率仍較低，提示藤黃酸這種藥物作用于人結腸癌HCT116細胞時主要是由于對細胞周期阻滯的誘導作用，從而在一定程度上抑制了HCT116細胞的生長及增殖。

綜上所述，藤黃酸對人結腸癌HCT116細胞的增殖具有明顯的抑制作用并可誘導其凋亡，其機制可能是通過抑制Gankyrin的表達實現的。因此藤黃酸能夠有效地誘導結腸癌細胞凋亡，在結腸癌的預防和治療中具有廣闊的應用前景，但其作用機制仍需進一步闡明。

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（收稿日期：2015-11-12 本文編輯：任 念）