淫羊藿次苷Ⅱ對大鼠坐骨神經損傷后功能恢復和神經再生的影響

彭晴 劉濤 余昌胤

淫羊藿次苷Ⅱ對大鼠坐骨神經損傷后功能恢復

和神經再生的影響

彭 晴1 劉 濤1 余昌胤1 李國艷1 龔其海2

1.遵義醫學院附屬醫院神經內科，貴州遵義 563000；

2.遵義醫學院基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州遵義 563099

[摘要] 目的 觀察淫羊藿次苷Ⅱ（IcsⅡ）對大鼠坐骨神經鉗夾損傷后功能恢復和神經再生的影響。 方法 將64只雄性SD大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和IcsⅡ治療組，每組16只，觀察時間點為4、8周，每個時間點8只。取右側臀部斜切口、距梨狀肌5 mm處鉗夾5 min損傷坐骨神經，損傷寬度為3 mm。IcsⅡ治療組在建模后即日起予以IcsⅡ 4 mg/（kg·d）連續灌胃。采用坐骨神經指數（SFI）觀察坐骨神經功能恢復情況，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腓腸肌形態學變化，Masson染色觀察坐骨神經組織學變化，免疫組織化學法檢測坐骨神經生長相關蛋白（GAP-43）表達。 結果 在4周和8周時：①神經功能：IcsⅡ治療組大鼠神經功能恢復更快，SFI指數（分）均高于模型組[（-56.77±3.42）比（-79.07±14.44），（-19.52±17.85）比（-75.37±7.23）]（P < 0.05）；②腓腸肌形態學：IcsⅡ治療組腓腸肌肌纖維截面積（μm2）明顯高于模型組[（5201.11±453.44）比（2618.81±514.26），（10 784.99±978.20）比（3222.21±400.01）]（P < 0.05），腓腸肌濕質量殘存率（%）高于模型組[（53.86±7.76）比（39.88±9.07），（71.67±15.18）比（48.86±6.71）]（P < 0.05）；③坐骨神經組織學：IcsⅡ治療組坐骨神經軸突數目（個）高于模型組[（394.50±12.02）比（160.50±9.19），（474.50±33.24）比（289.50±6.36）]（P < 0.05），平均光密度高于模型組[（0.462±0.036）比（0.455±0.004），（0.484±0.011）比（0.462±0.016）]（P < 0.05）；④免疫組織化學法：IcsⅡ治療組坐骨神經GAP-43蛋白平均光密度值比模型組高[（0.175±0.012）比（0.166±0.006），（0.196±0.010）比（0.169±0.006）]（P < 0.05）。以上各項指標，模型組和治療組均低于正常組和假手術組（P < 0.05），正常組和假手術組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 IcsⅡ能促進坐骨神經鉗夾損傷后的功能恢復，促進神經再生。

[關鍵詞] 淫羊藿次苷Ⅱ；坐骨神經；神經再生

[中圖分類號] R745.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（b）-0012-05

Effects of Icarisid Ⅱ on functional recovery and nerve regeneration after sciatic nerve injury in rats

PENG Qing1 LIU Tao1 YU Changyin1 LI Guoyan1 GONG Qihai2

1.Department of Neurology Medicine， Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Guizhou Province， Zunyi 563000， China； 2.Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education， Zunyi Medical University， Guizhou Province， Zunyi 563099， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Icarisid Ⅱ （IcsⅡ） on functional recovery and nerve regeneration after sciatic nerve crush injury in rats. Methods A total of 64 male SD rats were randomly divided into four groups： normal group， sham operation group， model group and IcsⅡ group， with 16 rats in each group. There were 2 observation time points in every group： 4 and 8 weeks with 8 rats in each time point. The injuries of sciatic nerve were created through an oblique incision （3 mm in width） in right buttock at the inferior boarder 5 mm below the piriformis for 5 min. IcsⅡ group was administered by IcsⅡ at a dose of 4 mg/（kg·d） by gavage on 1st day after modeling. The functional recovery was evaluated by sciatic functional index （SFI）. Morphological change in gastrocnemius was observed by hematoxylin-eosin （HE） staining after the rats were sacrificed. Histological change in sciatic nerve was observed by Masson staining. Immunohistostaining was used to detect the expression of growth associated protein-43 （GAP-43）. Results At 4 weeks and 8 weeks， ①nerve function： the functional recovery after the use of IcsⅡ was faster than that of model group， the scores of SFI （points） in IcsⅡ group were higher than those of model group [（-56.77±3.42） vs （-79.07±14.44）， （-19.52±17.85） vs （-75.37±7.23）] （P < 0.05）； ②morphological change in gastrocnemius： the transverse areas of muscle fiber （μm2） were significantly higher than those of model group [（5201.11±453.44） vs （2618.81±514.26）， （10 784.99±978.20） vs （3222.21±400.01）] （P < 0.05）， so as the recovery rate of gastrocnemius muscle's wet weight （%） [（53.86±7.76） vs （39.88±9.07）， （71.67±15.18） vs （48.86±6.71）] （P < 0.05）； ③histological change in sciatic nerve： the number of sciatic axons in IcsⅡ group was higher than that of model group [（394.50±12.02） vs （160.50±9.19）， （474.50±33.24） vs （289.50±6.36）] （P < 0.05）， the same as its average optical density [（0.462±0.036） vs （0.455±0.004）， （0.484±0.011） vs （0.462±0.016）] （P < 0.05）； ④immunohistostaining： the average optical density of GAP-43 protein in IcsⅡ group was higher than that of model group [（0.175±0.012） vs （0.166±0.006）， （0.196±0.010） vs （0.169±0.006）] （P < 0.05）. The indexes above of model group and IcsⅡ group were lower than those of normal group and sham operation group（P < 0.05）. There was no statistically significant difference between the normal group and the sham operation group （P > 0.05）. Conclusion IcsⅡ can effectively improve the functional recovery， promote nerve regeneration after sciatic nerve crush injury in rats.

[Key words] Icarisid Ⅱ； Sciatic nerve； Nerve regeneration

周圍神經病變恢復時間長、治療難度大，臨床常用有效的藥物主要是神經生長因子，但由于副作用及價格因素導致其使用受限。我國傳統中藥淫羊藿提取液、淫羊藿苷、牛膝和銀杏葉提取物具有促進周圍神經再生作用，丹參可以促進坐骨神經組織神經生長因子的表達[1-2]。從傳統中藥中尋找價廉、副作用小、能長期應用的藥物促進周圍神經損傷后功能恢復和神經再生具有重要的臨床意義。淫羊藿次苷Ⅱ（icarisid Ⅱ，IcsⅡ）是從淫羊藿中提取的一種多羥基黃酮類單體成分，是淫羊藿的有效成分之一，具有治療勃起功能障礙、抗缺血性腦損傷、抗腫瘤等作用[3-5]，但其是否能促進周圍神經損傷的恢復鮮見相關報道。本研究通過鉗夾大鼠坐骨神經復制坐骨神經損傷模型，采用IcsⅡ干預觀察神經功能恢復和坐骨神經改變，探討IcsⅡ對坐骨神經損傷后功能恢復和神經再生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康清潔級SD雄性大鼠64只，2～3月齡，體重（236.47±13.84）g，購于第三軍醫大學醫學實驗動物中心，合格證號：SCXK（渝）2012-0005。動物處理方法符合我國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。將大鼠按體重遞增順序編號，采用隨機數字法分為正常組、假手術組、模型組和IcsⅡ治療組。所有大鼠均在溫度20～25℃、濕度40%～60%的動物飼養室中統一標準喂養。

1.2 主要試劑和儀器

IcsⅡ，純度99.1%，購于南京澤朗醫藥有限公司；FA2004N電子天平購于上海菁海儀器有限公司；TH4-200倒置相差顯微鏡購于Olympus公司；GAP-43抗體購于proteintech公司；PV6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物、山羊血清（ZLI-9022）、濃縮型DAB試劑盒（ZLI-9032）和Harris蘇木精染液（ZLI-9609）均購于北京中杉金橋公司。

1.3 模型制作及給藥方法

參照王維等[6]報道的方法改進并建立大鼠坐骨神經鉗夾損傷模型：麻醉大鼠，俯臥固定，脫毛、消毒，沿股后部切開、分離、游離右側坐骨神經主干。在距梨狀肌下緣5 mm處用新17 cm長止血鉗尖端（第二扣）鉗夾5 min，寬度為3 mm，鉗夾后見坐骨神經菲薄，于神經損傷點處用10-0號顯微縫線標記，逐層縫合。假手術組只暴露右側坐骨神經，不鉗夾；正常組不做任何處理；IcsⅡ治療組在模型組的基礎上予以IcsⅡ 4 mg/（kg·d）連續灌胃，其余各組予以等體積的雙蒸水連續灌胃。自實驗開始每只大鼠連續3 d肌注青霉素鈉80 000 U。

1.4 大鼠一般情況與行為學觀察

實驗開始后每日觀察各組大鼠右下肢癱瘓及失神經性皮膚營養不良表現，如足外翻、足趾并攏、展爪反射消失、拖曳行走、足趾紅腫、自噬及皮膚潰瘍形成等。

1.5 坐骨神經指數（SFI）測定

參照文獻[7]的方法，分別于第4、8周采用自制寬8.5 cm、長50 cm、高10 cm的大鼠足印行走箱，一端做一暗箱以便大鼠進入。將白紙裁成行走箱等長等寬，每次測量前墊于箱底。握住大鼠將雙后足置于吸有炭黑墨水的海綿墊上蘸取墨水后放入行走箱一端，讓其自行走入暗室端，每側3或4個足印留于紙上，各組收集完畢后測量。選右足（E）和左足（N）足印測定以下3個變量：①足印長度（podogram length，PL）：從足跟到足尖的距離；②足趾寬度（width between the first and fifth toes，TW）：第1趾到第5趾連線距離；③中間足趾距離（inter-toes distance，IT）：第2趾到第4趾連線距離。精確到mm，使用最大一組數據。將上述三個變量帶入Bain公式計算SFI。SFI=-38.3（EPL-NPL/NPL+109.5（ETW-NTW）/NTW +13.3（EIT-NIT）/NIT-8.8（SFI值在0±11之間為正常，-100為神經完全損傷，在-11～-100之間表示坐骨神經部分損傷或功能恢復）。

1.6 腓腸肌濕質量殘存率、肌細胞截面積測定

第4、8周，麻醉后完整切取雙側小腿腓腸肌，吸去附著血液后測量濕體重質量，計算腓腸肌濕質量殘存率。然后右側腓腸肌立即用10%甲醛溶液固定、包埋，行橫向石蠟切片，厚度為3 μm行HE染色，在40倍顯微鏡下拍照，通過Image-Pro Plus 6.0分析軟件，計算每張圖片的肌細胞平均截面積。腓腸肌濕質量殘存率=右側手術側腓腸肌濕質量/左側健側腓腸肌濕質量×100%。

1.7 坐骨神經Masson染色

第4、8周，麻醉各組大鼠暴露手術側坐骨神經，取鉗夾損傷后10-0號線標記處坐骨神經標本，放入10%甲醛溶液固定、包埋，橫向石蠟切片，厚度為3 μm行Masson染色；使用倒置顯微鏡，放大40倍光鏡，定標值為20 μm條件下，通過Image-Pro Plus 6.0分析軟件，計數損傷處橫斷面上所有的神經軸突數目及平均光密度。

1.8 GAP-43免疫組織化學染色

第4周和8周時，大鼠麻醉后取出鉗夾處坐骨神經，常規石蠟包埋，連續橫切片，切片厚度3 μm，每組選取坐骨神經組織切片各4張，行GAP-43免疫組化染色，操作按說明書進行，DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸酒精分化后中性樹脂封片保存。GAP-43陽性表達呈棕黃色。染色玻片在40倍顯微鏡下觀察拍照，通過Image-Pro Plus 6.0分析軟件，計算每張圖片的平均光密度值。

1.9 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學及SFI值變化

模型組和IcsⅡ治療組大鼠均出現足下垂、足趾并攏、展爪反射消失、拖曳行走等右下肢癱瘓癥狀，SFI值近-100。模型組第2天開始，大部分大鼠右下肢趾間關節出現足趾紅腫、潰瘍、肌肉萎縮甚至斷趾等失神經性營養不良；而IcsⅡ治療組僅個別大鼠出現。第4周時兩組大鼠跛行改善，足趾腫脹潰瘍大部分恢復，出現展爪反射和后瞪動作；第8周時鼠爪明顯張開，模型組和IcsⅡ治療組均有不同程度改善。各組SFI值結果顯示，第4、8周模型組和IcsⅡ治療組均較正常組和假手術組明顯降低（P < 0.05）；與模型組比較，IcsⅡ治療組SFI值明顯增高（P < 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠坐骨神經指數比較（x±s，n = 8）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與假手術組比較，#P < 0.05；與模型組比較，△P < 0.05

2.2 腓腸肌形態學及濕質量殘存率

正常組和假手術組各時間點腓腸肌飽滿，有彈性與光澤。模型組和IcsⅡ治療組右側腓腸肌較健側萎縮，第8周時部分恢復，以IcsⅡ治療組恢復最為明顯。各組大鼠腓腸肌肌細胞截面積和殘存率結果顯示，在第4周和第8周時，與正常組和假手術組比較，模型組和IcsⅡ治療組肌細胞截面積減小，殘存率降低（P < 0.05）；與模型組比較，IcsⅡ治療組肌細胞截面積增加，殘存率增高（P < 0.05）。見表2、圖1。

2.3 坐骨神經Masson染色

髓鞘呈淡紅色，施萬細胞核呈深紅褐色，神經膜呈藍色，清晰可靠。正常組、假手術組神經纖維排列規則、致密；模型組神經纖維排列紊亂，缺失、不規則；IcsⅡ組可見神經排列基本規則，較致密。各組大鼠坐骨神經軸突數目、平均光密度值變化結果顯示：第4周和第8周時，模型組和IcsⅡ治療組與正常組和假手術組比較，坐骨神經軸突數目減少，平均光密度值降低（P < 0.05）；與模型組比較，IcsⅡ治療組坐骨神經軸突數目增多，平均光密度增高（P < 0.05）。見表3、圖2（封三）。

2.4 GAP-43免疫組織化學染色

第4周和8周時，GAP-43在各組坐骨神經均有表達。各時間點坐骨神經GAP-43蛋白平均光密度值結果顯示，模型組和IcsⅡ治療組表達較正常組和假手術組高（P < 0.05），而IcsⅡ治療組表達較模型組高（P < 0.05）。見表4、圖3（封三）。

3 討論

大鼠坐骨神經損傷模型廣泛用于周圍神經再生的實驗研究，鉗夾是一種非離斷性損傷，具有損傷程度較離斷性損傷輕、恢復較快、觀測周期短等特點。通過免疫組織化學染色結果顯示，本研究坐骨神經鉗夾損傷后神經束斷裂，軸突、神經內膜、神經束膜破壞，僅靠完整的神經外膜維持神經干的連續性，相當于Sunderland Ⅳ度損傷。鉗夾傷后坐骨神經再生不受修復方式的影響，因此消除了修復方法對周圍神經損傷后功能恢復結果觀察的干擾，保證了實驗結果的可靠性。

周圍神經損傷后神經功能的恢復取決于軸突再生的數目和質量[8-9]。本研究通過觀察失神經表現、測定SFI值、腓腸肌濕質量殘存率及截面積變化，發現模型組坐骨神經鉗夾損傷后神經缺失癥狀嚴重，在第4周和第8周時，有不同程度恢復，表明坐骨神經鉗夾損傷后其功能能自發緩慢部分恢復；而IcsⅡ治療組較模型組恢復快，表明IcsⅡ能促進大鼠坐骨神經鉗夾損傷后功能恢復。這與國內外用淫羊藿苷及淫羊藿提取物促進周圍神經損傷后功能恢復一致[1-2]。在第8周時IcsⅡ治療組仍未完全恢復，尚需更長時間觀察其能否使鉗夾損傷的坐骨神經完全恢復。

神經軸突數目及結構是功能的基礎，本研究發現坐骨神經鉗夾損傷后神經纖維排列紊亂、缺失、不規則，IcsⅡ治療組神經排列基本規則，較致密，而正常組、假手術組神經纖維排列規則、致密。GAP-43與神經發育、軸突再生、突觸可塑性密切相關，主要分布于神經元、再生的施萬細胞和神經膠質細胞，參與神經元損傷后軸突再生和突觸重構過程，當神經再生完成后，GAP-43又恢復到正常水平[9]，被認為是神經發育和再生的重要因子和神經損傷后再生的標志性蛋白[10-11]。同時GAP-43具有促進神經纖維再生作用[12]。本研究發現GAP-43蛋白在模型組有一定的表達，進一步表明坐骨神經鉗夾損傷后具有自我修復能力；IcsⅡ治療組GAP-43表達較模型組高，說明神經損傷修復活躍，也提示GAP-43可能是IcsⅡ促進鉗夾損傷后坐骨神經恢復的作用靶點之一。

關于淫羊藿提取物促進神經損傷的機制方面，Tohda等[13]在對脊髓損傷的研究中發現，淫羊藿苷促進脊髓損傷后運動功能恢復可能與其抑制促分裂原活化蛋白激酶（p38-mitogen activated protein kinase，p38MAPK）有關。Zeng等[14]發現淫羊藿苷通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-knase，PI3K）/Akt通路從而抑制葡萄糖合成激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）的激活，抑制Tau蛋白過度磷酸化，觸發細胞骨架結合蛋白調節細胞骨架的延伸。Li等[15]和Gu等[16]發現IcsⅡ能提高ERK1/2、Akt和JNK1/2磷酸化水平，保護高血糖誘導的人海綿竇內皮細胞損傷。Bai等[17]發現IcsⅡ能改善勃起功能，增加盆腔神經節神經生長因子（NGF）和神經型一氧化氮合酶（nNOS）的表達；NGF具有明確的促進周圍神經再生的作用，也可以通過抑制p38MAPK活性促進神經再生[18-19]。此外，軸突再生抑制因子以及與之有關的ROCK信號通路、排斥導向分子等多種機制均參與抑制或促進軸突再生[20]。因此，IcsⅡ促進周圍神經修復的分子機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2015-11-04 本文編輯：張瑜杰）