Toll樣受體1基因多態性與華北地區漢族人群支氣管哮喘關系的研究

許文苑 丁召磊 許振

[摘要] 目的 探討Toll樣受體1（TLR1）基因外顯子3區的單核苷酸多態性（SNP）與華北地區漢族人群支氣管哮喘之間的關系。 方法 選取山東省濰坊市人民醫院（以下簡稱“我院”）呼吸科2014年1月～2015年1月收治的支氣管哮喘患者100例為哮喘組，選取同期在我院健康查體100例為對照組，采集外周血并提取全基因組DNA。采用聚合酶鏈反應-高分辨率熔解曲線（PCR-HRM）技術和DNA測序技術檢測TLR1外顯子3區的基因多態性。比較哮喘組和對照組等位基因和基因型的分布差異。 結果 哮喘組與對照組TLR1基因SNP的rs5743596分布差異無統計學意義（P > 0.05）。哮喘組與對照組等位基因C和T的分布頻率差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 TLR1基因rs5743596位點的多態性與支氣管哮喘易感性之間關系不大。

[關鍵詞] Toll樣受體1；單核苷酸多態性；高分辨率熔解曲線技術；支氣管哮喘

[中圖分類號] R562.2+5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（b）-0017-04

Association analysis between polymorphism of Toll-like receptors 1 and susceptibility to asthma of Han people in North China

XU Wenyuan1 DING Zhaolei2 XU Zhen3 SHENG Jianhui1 TAN Wei2

1.Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261042， China； 2.Department of Respiratory Medicine， People′s Hospital of Weifang City， Shandong Province， Weifang 261041， China； 3.Department of Surgery， Maternal and Child Health Hospital of Ningyang County， Shandong Province， Ningyang 271400， China

[Abstract] Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphisms （SNP） of excon-3 in Toll-like receptors 1 （TLR1） and susceptibility to asthma of Han people in North China. Methods 100 patients with asthma treated in Respiratory Department， People′s Hospital of Weifang City in Shandong Province （"our hospital" for short） from January 2014 to January 2015 were selected as asthma group， in the same period， 100 cases with kindergarden in our hospital were selected as control group. DNA samples were taken from their peripheral blood. Polymerase chain reaction-high resoution melting （PCR-HRM） technique and DNA sequencing technique were employed to detect the polymorphisms of excon-3 in TLR1. And meanwhile， distribution of allele and genotype between asthma group and control group were measured. Results There was no statistical difference in the distribution of TLR1-rs5743596 between asthma group and control group （P > 0.05）. There were no statistical significantly differences in the allele frequencies of C and T between asthma group and control group （P > 0.05）. Conclusion The rs5743596 of TLR1-SNP may not be involved in the susceptibility to asthma.

[Key words] Toll-like receptors 1； Single nucleotide polymorphism； High resolution melting technique； Asthma

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種以氣道高反應性和多種炎癥細胞（中性粒細胞、嗜酸粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞等）浸潤為特征的氣道慢性炎癥。據世界衛生組織統計，目前患哮喘人數高達2.35億人[1]。哮喘的患病率不斷增長，有人提出哮喘的發生與吸煙、肥胖、過敏性疾病、暴露于顆粒物有密切的聯系[2-4]。哮喘的發病機制已逐漸受到人們的關注。

免疫學研究認為，機體在遺傳基礎上受到外界刺激物影響時，外周血中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞等可通過分泌細胞因子，導致Th1/Th2比列失衡，從而導致哮喘的發生[5]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為新近發現的細胞跨膜受體，他們主要分布于單核細胞、粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）等多種免疫細胞表面[6]。

近年來，TLRs單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與哮喘的關系備受關注。研究結果顯示，Toll樣受體2（Toll-like receptors 2，TLR2）、Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）、Toll樣受體6（Toll-like receptors 6，TLR6）、Toll樣受體9（Toll-like receptors 9，TLR9）、Toll樣受體10（Toll-like receptors 10，TLR10）的基因多態性可能與哮喘或特應性體質有關[7-11]。但有關Toll樣受體1（Toll-like receptors 1，TLR1）基因多態性與哮喘關系的研究，目前國內幾乎空白。本文通過對哮喘與TLR1外顯子3區基因多態性的研究，旨在探討哮喘與TLR1基因rs5743596位點多態性之間的關系，對哮喘的預防及早期治療做進一步指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取山東省濰坊市人民醫院（以下簡稱“我院”）呼吸科2014年1月～2015年1月收治，能夠留取血標本并自愿參與實驗的成人哮喘患者100例作為哮喘組，其中男67例，女33例；平均年齡（50.44±19.21）歲。診斷標準參考中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組所制訂的支氣管哮喘防治指南。剔除標準[12]：①合并其他呼吸系統疾病，如慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張等；②診斷為良性或惡性腫瘤；③有真菌、病毒、寄生蟲感染者；④明確伴有自身免疫性疾病等。另選取同期在我院健康查體并取得知情同意后的健康成人志愿者100例作為對照組，其中男56例，女44例；平均年齡（48.26±17.59）歲。兩組研究對象均為華北地區漢族人群，且均無血緣關系。兩組的性別、年齡比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 樣本選取 每位受試者抽取空腹靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝，置于-20℃保存備用。

1.2.2 DNA基因組提取 按照DNA提取試劑盒所示步驟提取所有樣本的DNA。通過電泳鑒定DNA提取成功，通過Nanodrop2000微量紫外分光光度儀測定提取基因組DNA的濃度和純度，終濃度4.5～5.5 ng/μL，純度OD260/OD280為1.8～2.0。-20℃保存備用。

1.2.3 引物設計 在NCBI的數據庫查找TLR1人的DNA序列和RNA序列信息，根據外顯子序列區域利用軟件Primer 5.0設計相關引物，引物設計本著分段重復、覆蓋的設計原則，設計的引物最后采用Oligo7.0驗證引物的特異性及穩定性，并送至公司合成引物，正向引物為5′-CCTTGCTCAGGGTCTTCATG-3′，反向引物為5′-CTTACCCTTTTGTAGGGGTGC-3′。

1.2.4 運用高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）進行基因分型 采用HRM技術擴增基因組DNA片段并進行基因分型，獲得HRM分析結果，從而判定樣品的SNP類型。實驗所用試劑Light Cycler⑧480 High Resolution Melting Master購自羅氏公司。標準品的制備及PCR-HRM反應總體系：標準品由前期測序直接獲得。總體積20 μL，其中HRM Master 10 μL、正反向引物各1 μL、全基因組DNA 3 μL、MgCl2 1.6 μL、去離子水3.4 μL。PCR反應條件如下：95℃預變性120 s，然后94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，共55個循環。在進行HRM分析之前，進行變性和復性處理，反應條件如下：95℃ 60 s，54℃ 10 s。HRM過程從54℃開始，以1℃/s的斜率采集熔解曲線，到95℃結束，并在Light Cycler 480基因掃描軟件模塊上進行分析。每次反應均需將已知基因型的標準品與待測樣本同時進行檢測。根據HRM的形狀判斷基因型，與標準品曲線形狀相同者被認定為與標準品基因型相同，從而獲得未知待測樣品的基因型。

1.2.5 測序驗證 用DNA測序結果驗證HMR檢測結果的準確性，通過PCR技術擴增TLR1基因中包含rs5743596位點的DNA片段，擴增片段經過純化后直接用于測序分析。隨機抽取30份PCR產物進行測序，由上海立菲生物技術有限公司完成。PCR擴增用引物，正向引物為5′-TTTCCGGGTCTTTCAGCC-3′，反向引物為5′-AAGCACCAAATTCCTCTTCACA-3′，PCR擴增體系為：總體系50 μL，其中正反向引物各2 μL、全基因組DNA 5μL、Taq酶25 μL、去離子水16 μL。反應條件：94℃預變性5 min，然后94℃變性45 s，64℃退火1 min，72℃延伸45 s，共40個循環，最后72℃延伸5 min。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HRM分析

圖1A（封三）為TLR1基因標準熔解曲線，圖1B（封三）為標準化的溫度變化曲線，代表不同基因型熔解曲線的形狀和顏色，因溫度的變化發生改變，結合不同熔解曲線樣本經測序的結果（圖2），其中綠色表示雜合子突變型CT，藍色表示純合子突變型TT，紅色表示野生型CC。測序結果通過查閱NCBI和GenBank發現該突變位點位于TLR1基因的rs5743596位點。

A：野生型CC基因型的測序結果，黑色箭頭指向C等位基因；B：純合子突變型TT基因型的測序結果，箭頭指向T等位基因；C：雜合子突變型CT基因型的測序結果，黑色箭頭指向CT雜合基因

圖2 不同熔解曲線樣本經測序的結果

2.2 遺傳平衡檢驗

哮喘組人群TLR1基因rs5743596位點的基因型頻率比較，差異無統計學意義（χ2=1.013，P=0.310）；對照組人群TLR1基因rs5743596位點的基因型頻率比較，差異無統計學意義（χ2=3.630，P=0.056）。哮喘組和對照組中該位點的基因型頻率無顯著性差異，證明符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，本研究人群具有群體代表性。見表1。

表1 遺傳平衡檢驗

2.3 哮喘組和對照組各基因型和等位基因分布頻率比較

哮喘組TLR1基因rs5743596位點的各基因型與對照組比較，差異無統計學意義（χ2=4.988，P=0.083）；哮喘組與對照組TLR1基因rs5743596位點的等位基因分布頻率比較，差異無統計學意義（χ2=0.604，P=0.437）。見表2。

表2 哮喘組和對照組各基因型和等位基因分布頻率比較[n（%）]

3 討論

TLRs是近年來研究的熱點，Koponen等[13]、袁欣等[14]認為，TLRs在先天性免疫系統中起重要作用，TLRs基因的表達與哮喘等自身免疫性疾病有密切關系。哮喘是一種復雜的多因素疾病，基因-環境在哮喘的發病中起重要作用，遺傳因素可以引起TLRs基因的多態性[15]，而環境因素又可以通過TLRs調節Th1/Th2平衡[16]，從而影響哮喘的發病。Hussein等[17]、Werner等[18]發現，TLRs基因（主要為TLR2和TLR4基因）編碼的改變，可以增加哮喘患病的危險性。所以進一步研究由遺傳因素決定的TLRs多態性與哮喘之間的關系問題，對于明確哮喘的發病機制以及治療方法具有非常重要的意義。目前TLR2、TLR4等亞家族基因多態性與哮喘的研究已成為眾多實驗研究的熱點，而對于TLR1的研究國內外尚未完善。

TLR1位于人基因組4p14，長度為8537 bp，有4個外顯子區（exon），分別位于-5960～-5923、-5551～-5475、-2117～-2026、-67～2576。TLR1作為TLRs的亞家族，表達于多種免疫細胞受體，在免疫應答和感染中起重要作用，與哮喘炎癥及氣道重塑關系密切[19-20]。我國人群中，對于TLRs SNP與哮喘關系的研究尚未開展，為了進一步了解哮喘的發病機制，有必要對我國人群哮喘相關的TLRs SNP進行篩選。本實驗著重研究外顯子片段3的SNP位點與哮喘的關系。

本研究對哮喘組患者的TLR1外顯子3進行測序研究，發現一個SNP，位于rs5743596位點的C突變為T，經過χ2檢驗，差異無統計學意義，說明此位點的等位基因分布頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。TLR1基因rs5743596位點在我國華北地區漢族人群中存在，且存在3種基因型，分別為CC、CT、TT型。本實驗結果顯示，與對照組比較，哮喘組TLR1基因位點rs5743596基因型分布以及等位基因的分布頻率差異無統計學意義（P > 0.05），因此rs5743596位點的SNP與哮喘易感性之間關系不大。但是不同人群之間等位基因分布頻率差異較大，本研究僅局限于中國華北地區漢族人群，有可能導致該結果并不適用于其他地域或種族人群；其次，對于TLR1基因的其他SNP位點是否與哮喘的發生相關，仍需進一步研究。本研究首次對華北地區人群TLR1基因的多態性與哮喘關系進行了探討，它將為今后在漢族人群中開展TLR1基因的多態性與哮喘及其他疾病相關性的研究奠定基礎。

[參考文獻]

[1] WHO. 10 facts on asthma [EB/OL]. （2013）http：//www.who.int/features/factfiles/asthma/asthma_facts/zh/-4k.

[2] von Mutius E，Martinez FD，Fritzsch C，et al. Prevalence of asthma and atopy in two areas of West and East Germany [J]. Am J Respir Crit Care Med，1994，149（2 Pt 1）：358-364.

[3] 中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組.支氣管哮喘防治指南（支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案）[J].中華結核和呼吸雜志，2008，31（3）：177-185.

[4] Riedler J，Braun-Fahrl？覿nder C，Eder W，et al. Exposure to farming in early life and development of asthma and allergy：a cross-sectional survey [J]. Lancet，2001，358（9288）：1129-1133.

[5] Yang IA，Fong KM，Holgate ST，et al. The role of Toll-like receptors and related receptors of the innate immune system in asthma [J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol，2006， 6（1）：23-28.

[6] 馬力，王亞亭.Toll樣受體在機體免疫應答中的調節作用[J].實用兒科臨床，2009，24（21）：1685-1688.

[7] Dabbagh K，Lewis DB. Toll-like receptors and T-helper-1/T-helper-2 responses [J]. Curr Opin Infect Dis，2003，16（3）：199-204.

[8] Novak N，Yu CF，Bussmann C，et al. Putative association of a TLR9 promoter polymorphism with atopic eczema [J]. Allergy，2007，62（7）：766-772.

[9] Yang IA，Barton SJ，Rorke S，et al. Toll-like receptor 4 polymorphism and severity of atopy in asthmatics [J]. Genes Immun，2004，5（1）：41-45.

[10] Tesse R，Pandey RC，Kabesch M. Genetic variations in Toll-like receptor pathway genes influence asthma and atopy [J]. Allergy，2011，66（3）：307-316.

[11] Michel O，LeVan TD，Stern D，et al. Systemic responsiveness to lipopolysaccharide and polymorphisms in the Toll-like receptor 4 gene in human beings [J]. J Allergy Clin Immunol，2003，112（5）：923-929.

[12] 孫鈺鋒，常曉悅，孫偉.TLR4和TNF-α基因多態性與支氣管哮喘的相關性研究[J].臨床肺科雜志，2013，18（4）：662-665.

[13] Koponen P，Vuononvirta J，Nuolivirta K，et al. The association of genetic variants in Toll-like receptor 2 subfamily with allergy and asthma after hospitalization for bronchiolitis in infancy [J]. Pediatr Infect Dis J，2014，33（5）：463-466.

[14] 袁欣，張倩，韋國楨，等.Toll樣受體3單核苷酸多態性單核苷酸多態性與中國東南方漢族人群哮喘關系的研究[J].南京醫科大學學報：自然科學版，2009，29（9）：1242-1246.

[15] Strachan DP. Family size，and atopy：the first decade of the "hygiene hypothesis" [J]. Thorax，2000，55（Suppl 1）：S2-S10.

[16] 陳育智.為在兒童哮喘管理中推廣應用“全球哮喘防治的創議”而努力[J].中華兒科雜志，1998，36（12）：707-708.

[17] Hussein YM，Awad HA，Shalaby SM，et al. Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 polymorphisms and susceptibility to asthma and allergic rhinitis：a case-control analysis [J]. Cell Immunol，2012，274（1-2）：34-38.

[18] Werner M，Topp R，Wimmer K，et al. TLR4 gene variants modify endotoxin effects on asthma [J]. J Allergy Clin Immunol，2003，112（2）：323-330.

[19] Camateros P，Tamaoka M，Hassan M，et al. Chronic asthma-induced airway remodeling is prevented by Toll-like receptor-78 ligand S28463 [J]. Am J Respir Crit Care Med，2007，175（12）：1241-1249.

[20] Moisan J，Camateros P，Thuraisingam T，et al. TLR7 ligand prevents allergen-induced airway hyperresponsiveness and eosinophilia in allergic asthma by a MYD88-dependent and MK2-independent pathway [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006，290（5）：L987-L995.

（收稿日期：2015-10-24 本文編輯：李亞聰）