子宮內(nèi)膜腺癌雌激素受體亞型的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系

陳國(guó)偉 周云霞 張潔清 等

[摘要] 目的 探討雌激素受體α（ERα）、ERβ在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。 方法 選擇2011年1月～2012年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)組織學(xué)證實(shí)的93例子宮內(nèi)膜腺癌（子宮內(nèi)膜癌組）及31例正常子宮內(nèi)膜（對(duì)照組）組織，分別采用qRT-PCR及免疫組化法檢測(cè)ERα、ERβ mRNA及蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 子宮內(nèi)膜癌組ERα mRNA 表達(dá)量及蛋白陽性表達(dá)率、ERα/ERβ mRNA均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；隨著臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)加深，ERα mRNA表達(dá)量、蛋白陽性表達(dá)率及ERα/ERβ mRNA比值逐漸下降（P < 0.05或P < 0.01）；子宮內(nèi)膜癌組ERβ mRNA及蛋白表達(dá)也降低，與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。子宮內(nèi)膜癌組織中ERα與ERβ陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)（r = -0.234，P < 0.05）。 結(jié)論 在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中，ERα的變化可能較ERβ更有意義，ERα/ERβ mRNA比值可作為判斷子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜腺癌；雌激素受體α；雌激素受體β

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（b）-0087-04

子宮內(nèi)膜癌被認(rèn)為是一種激素依賴性腫瘤，雌激素受體（ER）、孕激素受體水平的改變與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過PCR技術(shù)及免疫組化檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌中ERα、ERβ表達(dá)的變化，以探討其與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月～2012年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院因子宮內(nèi)膜癌手術(shù)治療切除的子宮內(nèi)膜組織93例（子宮內(nèi)膜癌組），年齡33～76歲，中位年齡53歲，術(shù)前均無雌、孕激素使用史。術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)。手術(shù)病理分期按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2009年的標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期55例，Ⅱ期18例，Ⅲ期16例，Ⅳ期4例。組織學(xué)分級(jí)：高分化45例，中分化28例，低分化20例。對(duì)照組選取因良性婦科腫瘤行子宮切除的正常子宮內(nèi)膜31例，其中增生期21例，分泌期10例，年齡36～54歲，中位年齡48歲。

1.2 主要試劑

Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）購(gòu)自美國(guó)Roche公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自加拿大Fermentas公司，鼠抗人單克隆抗體ERα購(gòu)自Santa Cruz公司，鼠抗人單克隆抗體ERβ購(gòu)自GeneTex公司，免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組組織中ERα mRNA和ERβ mRNA的表達(dá)

Trizol法提取各組組織總RNA，利用RT-PCR試劑盒合成cDNA。ERα基因引物序列，上游：5'-TGCCAAGGAGACTCGCTAC-3'，下游：5'-CTTCGTAGCATTTGC GGAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為209 bp；ERβ基因引物序列，上游：5'-GGTCCATCGCCAGTTATCACAT-3'，下游：5'-GATGCGTAATCGCTGC AGACAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為227 bp；以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參照，其引物序列，上游：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，下游：5'-GAAGATGGTGATGGGATTT C-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為225 bp。PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括DNA熒光染料SYBR Green 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，加水至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，35次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)ERα蛋白和ERβ蛋白的表達(dá)

石蠟切片（厚4 μm）經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3 %雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫浸泡，磷酸鹽緩沖液（PBS）振洗后，分別以鼠抗人單克隆抗體ERα 1∶200、或ERβ 1∶200，4℃孵育過夜，過氧化物酶標(biāo)志的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育，PBS振洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，樹膠封片。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立陽性及陰性對(duì)照，ER以已知陽性的乳腺癌切片作陽性對(duì)照，以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.5 結(jié)果判定

ERα、ERβ蛋白陽性染色主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核內(nèi)有黃色或棕黃色顆粒分布者即為陽性細(xì)胞。每張切片在陽性表達(dá)較高區(qū)域隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（400倍），每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERα、ERβ mRNA及蛋白在正常內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)

所有組織中均能檢測(cè)到ERα、ERβ mRNA的表達(dá)。子宮內(nèi)膜癌組中，ERα mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯下降，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；ERβ mRNA及蛋白的表達(dá)量也降低，與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）；ERα/ERβ mRNA比值較對(duì)照組明顯下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1、圖1。

表1 兩組子宮內(nèi)膜組織中ERα、ERβ mRNA及蛋白的表達(dá)

A、C：正常內(nèi)膜；B、D：子宮內(nèi)膜腺癌

圖1 不同子宮內(nèi)膜組織中ERα及ERβ的表達(dá)情況

（SP染色，100×）

2.2 子宮內(nèi)膜癌中ERα、ERβ的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期、高分化、肌層浸潤(rùn)深度<1/2、淋巴結(jié)陰性的內(nèi)膜組織中ERα mRNA的表達(dá)量、蛋白陽性表達(dá)率及ERα/ERβ mRNA比值均高于子宮內(nèi)膜癌Ⅱ～Ⅳ期、中低分、肌層浸潤(rùn)>1/2、淋巴結(jié)陰性的內(nèi)膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。子宮內(nèi)膜癌Ⅰ期、高分化、肌層浸潤(rùn)深度<1/2、淋巴結(jié)陰性的內(nèi)膜組織中ERβ mRNA的表達(dá)量及蛋白陽性表達(dá)率均低于子宮內(nèi)膜癌Ⅱ～Ⅳ期、中低分、肌層浸潤(rùn)>1/2、淋巴結(jié)陰性的內(nèi)膜組織，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。見表2。

表2 不同內(nèi)膜癌組織中ERα、ERβ mRNA及蛋白的表達(dá)情況

2.3 ERα與ERβ在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的關(guān)系

在子宮內(nèi)膜腺癌中，55例ERα 蛋白表達(dá)陽性的病例中，ERα與ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān) （r=-0.234，P < 0.05）。見表3。

表3 子宮內(nèi)膜癌中ERα與ERβ的關(guān)系（例）

3 討論

一般認(rèn)為子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與雌激素刺激有關(guān)，而雌激素主要通過雌激素受體發(fā)揮作用，是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)典的雌激素受體有ERα和ERβ兩種亞型，具有高度同源性，ERα基因位于染色體6q24，而ERβ 基因則位于14q22～24，兩者組織分布不一，與配體結(jié)合特性不同，提示它們可能具有不同的生物學(xué)作用[1]。

ER與配體結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化，ERα和ERβ形成同源或異源二聚體，參與靶器官、組織的增殖和分化的調(diào)控。有研究表明[2-3]，子宮內(nèi)膜組織從正常內(nèi)膜、增生內(nèi)膜到內(nèi)膜癌，ERα和ERβ的表達(dá)逐漸減少，說明ERα和ERβ均參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[4-5]。ERα mRNA的表達(dá)從正常組織或腫瘤G1到G3逐漸降低，ERα蛋白具有同樣的變化，ERβ mRNA和蛋白均無變化，結(jié)果表明ERα在子宮內(nèi)膜表達(dá)下調(diào)可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[6]。本研究結(jié)果顯示，ERα mRNA表達(dá)量及蛋白陽性表達(dá)率在正常內(nèi)膜、內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)呈明顯下降趨勢(shì)，ERβ mRNA及蛋白表達(dá)亦明顯下降，表明ER兩種亞型表達(dá)改變?cè)谥掳┻^程中都起作用，引起的信號(hào)傳導(dǎo)通路與它們的相互作用發(fā)生改變有關(guān)，但ERα表達(dá)在內(nèi)膜癌中的變化顯著高于ERβ，提示ERα表達(dá)的下調(diào)或缺失在內(nèi)膜癌的發(fā)生中起到重要的作用[5，7]，而ERβ可能起調(diào)節(jié)作用，通過影響癌基因來促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[8]。

Wilde等[9]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者在接受他莫昔芬治療過程中，由于他莫昔芬的抗雌激素作用，ERα的表達(dá)下調(diào)，推測(cè)雌激素主要通過ERα起作用，癌變到一定程度后對(duì)雌激素的反應(yīng)改變，ERα表達(dá)下降。本研究結(jié)果顯示，ERα的表達(dá)率隨著分期的升高、分級(jí)的增加、肌層浸潤(rùn)深度的加重其下調(diào)更為顯著，提示ERα表達(dá)下調(diào)與內(nèi)膜癌的發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與既往的研究[7，10]結(jié)果一致。高水平的ERα可抑制血管生成旁路而對(duì)子宮內(nèi)膜癌有抑制作用[11]。ERα的低表達(dá)或缺失與上皮-間質(zhì)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及不良預(yù)后呈正相關(guān)[12]，ERα的表達(dá)狀態(tài)可能提供了不依賴于子宮內(nèi)膜癌分期與分級(jí)的預(yù)后影響因素[13]。

ERβ在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制中的作用研究較少，且其表達(dá)具有一定的差異性。有研究發(fā)現(xiàn)，ERβ在晚期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)增加[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中ERβ mRNA水平明顯低于癌旁正常內(nèi)膜組織[15]。Shabani等[16]的研究顯示，ERβ的表達(dá)與內(nèi)膜癌臨床病理及預(yù)后無明顯相關(guān)性。本研究中，ERβ mRNA的表達(dá)量及蛋白陽性表達(dá)率在Ⅰ期與Ⅱ～Ⅳ期、組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)陰性與陽性、肌層浸潤(rùn)深度之間的表達(dá)差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均呈增加趨勢(shì)，提示ERβ mRNA的相對(duì)高表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌變中具有一定的作用，可能與預(yù)后不良有關(guān)[14，17]。

在許多研究中，子宮內(nèi)膜癌的惡性轉(zhuǎn)化與ERα/ERβ mRNA比值下降有關(guān)[14，18]。本研究中，ERα/ERβ mRNA比值與臨床分期、組織學(xué)分級(jí)及肌層浸潤(rùn)深度有關(guān)，ERα與ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)，說明兩者比例的改變與ERα水平下降和/或ERβ上升有關(guān)。在子宮內(nèi)膜惡變過程中存在ERα/ERβ mRNA比值的降低，這種改變可能歸結(jié)于ERα的下調(diào)及ERβ的上調(diào)[10]，ERα/ERβ mRNA比值≤1是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，ERα和ERβ的表達(dá)失衡，尤其是ERα/ ERβ比值，較單一的ERα或ERβ，對(duì)評(píng)估患者預(yù)后可能更具優(yōu)勢(shì)[19]。研究還發(fā)現(xiàn)，17β雌二醇由ERα介導(dǎo)能激活轉(zhuǎn)錄，而ERβ介導(dǎo)則表現(xiàn)為抑制轉(zhuǎn)錄，推測(cè)ERα和ERβ在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)方面各有分工，兩者的比例可能決定細(xì)胞對(duì)雌激素的反應(yīng)性[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)，ERα/ERβ mRNA比值隨著手術(shù)病理分期、組織學(xué)分級(jí)的升高和肌層浸潤(rùn)的加深而明顯下降，說明ERα/ERβ mRNA比值的降低與患者的不良預(yù)后具有一定的相關(guān)性，可作為判斷預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后評(píng)估可能需要共同分析ERα、ERβ而得到，兩者的變化對(duì)內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展的影響還需要進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2015-10-09 本文編輯：任 念）

Expression of estrogen receptor subtype and its relationship with clinicopathology in adenocarcinoma of endometrium

CHEN Guowei1，2 ZHOU Yunxia1 ZHANG Jieqing1▲ LI Li1

1.Department of Gynecologic Oncology， Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530021， China； 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Guangxi Medical University Fourth Hospital， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou 545005， China

[Abstract] Objective To explore the expression of estrogen receptor alpha （ERα） and beta （ERβ） and its relationship with clinical and pathological characteristics in tissues with adenocarcinoma of endometrium. Methods 93 cases of endometrial adenocarcinoma （endometrial adenocarcinoma group） and 31 cases of normal endometrium （control group） from January 2011 to December 2012 in Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University were selected， Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） and immunohistochemistry were used to detect the expression of ERα and ERβ in endometrial tissues of two groups. Results Expression of ERα mRNA and protein， ERα/ERβ mRNA were significantly lower in endometrial adenocarcinoma group than that in control group （P < 0.05 or P < 0.01）； with the increasing of clinical stages， histological grades and depth of myometrial invasion， the expression of ERα mRNA and protein， ERα/ERβ mRNA were significantly reduced （P < 0.05 or P < 0.01）； compared with the control group， expression of ERβ mRNA and protein in endometrial adenocarcinoma group were reduced， the difference was no statistically significant （P > 0.05）. There was a negative correction between ERα and ERβ in endometrial adenocarcinoma（r = -0.234， P < 0.05）. Conclusion ERα may play a different and more important role in the occurrence and development of endometrial carcinoma compared to ERβ， ERα/ERβ mRNA ratio can be used to judge prognosis of endometrial carcinoma.

[Key words] Endometrial adenocarcinoma； Estrogen receptor alpha； Estrogen receptor beta