兩種典型細菌的生長和氧化應激酶對鄰苯二甲酸二丁酯的響應

胡影，王志剛，徐偉慧，胡云龍，劉帥，由義敏，趙曉松，蘇云鵬

兩種典型細菌的生長和氧化應激酶對鄰苯二甲酸二丁酯的響應

胡影，王志剛*，徐偉慧，胡云龍，劉帥，由義敏，趙曉松，蘇云鵬

齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006

鄰苯二甲酸二丁酯（Di-n-butyl phthalate，DBP）是一種廣泛存在于環境中的有機污染物，對環境構成嚴重威脅，現已被中國環境監測中心列入優先控制污染物名單。本研究從黑土中分離出兩種典型細菌B. subtilis D13和E. coli Q5，以液體培養法接種于添加不同質量濃度（0、5、10、20、40、80 mg·L-1）DBP的LB培養基中，測定兩種菌株的生長曲線；以分光光度法測定其氧化應激酶系對DBP脅迫的應答反應。結果表明，（1）DBP污染可抑制細菌生長，在對數生長期抑制作用顯著，但隨著污染時間的延長，B. subtilis D13菌株生長量呈恢復趨勢，抑制作用減緩；DBP污染對E. coli Q5的抑制作用更為顯著，且菌株生長未出現恢復趨勢。（2）經DBP培養，6 h時兩種菌株的抗氧化應激酶對污染出現應答反應，SOD活性隨著污染物濃度的升高而增加。（3）兩種細菌的CAT、GST活性與SOD活性的變化趨勢基本一致，酶活呈現DBP低濃度誘導而高濃度抑制的趨勢。實驗結果可為進一步研究DBP對微生物的生態毒理效應提供理論基礎。

鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）污染；細菌的氧化應激酶活性

引用格式：胡影， 王志剛， 徐偉慧， 胡云龍， 劉帥， 由義敏， 趙曉松， 蘇云鵬. 兩種典型細菌的生長和氧化應激酶對鄰苯二甲酸二丁酯的響應［J］. 生態環境學報， 2016， 25（7）： 1225-1229.

HU Ying， WANG Zhigang， XU Weihui， HU Yunlong， LIU Shuai， YOU Yim in， ZHAO Xiaosong， SU Yunpeng. Response of Bacterial Grow th and the Activities of Oxidative Enzymes to Di-n-butyl Phthalate Contam ination ［J］. Ecology and Environmental Sciences，2016， 25（7）： 1225-1229.

鄰苯二甲酸酯（Phthalate esters，PAEs）類化合物作為塑料制品的成型劑而被廣泛使用（Xia et al.，2011），而鄰苯二甲酸二丁酯（Di-n-butyl phthalate，DBP）是PAEs中應用最為廣泛的一種。由于塑料制品的長期大量使用，DBP已成為我國最為普遍的有機污染物之一，在土壤、水體、空氣以及沉積物中均被檢出（Kong et al.，2012；Sun et al.，2013；He et al.，2015）。土壤中的DBP源自于農膜、農藥、殺蟲劑和化肥等的使用，其中農膜是導致其含量超標的主要原因（Wang et al.，2015；Zhang et al.，2015a），且與塑料薄膜的使用量有顯著關聯性（Wang et al.，2013）。目前，我國部分東北黑土的DBP平均污染含量為7.60 mg·kg-1（Xu et al.，2008），遠超美國環保署制定的安全標準（Niu et al.，2014；朱媛媛等，2012），已對黑土肥力和生產力構成嚴重威脅。

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成成分，可參與土壤的物質循環，并優化土壤生態，是評價土壤健康及土壤生態系統功能的重要指標（宋長青等，2013；Diacono et al.，2010）。前人在群體水平上的研究發現，PAEs類污染可抑制黑土微生物的呼吸速率與微生物代謝熵（王志剛等，2015a），DBP污染能改變黑土功能微生物的豐度與黃瓜根際微生物群落結構（王志剛等，2015b；Zhang et al.，2015b），然而，單一種類微生物對DBP污染的響應過程尚不明確。生物體的抗氧化應激酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉移酶（GST）等，他們對環境脅迫尤為敏感，其活性可被氧化應激所誘導而做出積極的應答反應。因此，研究黑土典型微生物的生長和抗氧化應激酶對DBP污染的響應，對于闡明DBP的生態毒理效應具有重要意義。

1　材料與方法

1.1菌株與菌體收集

革蘭氏陽性菌株B. subtilis D13和革蘭氏陰性菌株E. coli Q5均從齊齊哈爾市克山縣黑土耕層中分離純化，由齊齊哈爾大學環境微生物實驗室保存。將分離的菌株接種于LB培養基（pH 7.0）中活化，30 ℃、轉速130 r·m in搖床培養。

1.2生長曲線測定

DBP（純度≥99.9%）購于中國標準物樣品信息中心，助溶劑為丙酮，制備成1000 mg·L-1儲備液，于4 ℃冰箱保存備用。將處于對數生長期的菌株按2%的接種量接入添加不同質量濃度（0、5、10、20、40、80 mg·L-1）DBP的LB培養基（pH 7.0）中，30 ℃下振蕩培養；于600 nm波長下測定菌液吸光值，以0 mg·L-1DBP為空白對照，每處理3組平行。

1.3粗酶液制備與酶活性測定

分別于0、6、24 h吸取細菌培養液，參照王志剛等（2015c）的方法制備粗酶液。以DBP處理0 h為對照，每處理3組平行。

采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，參照說明書測定抗氧化酶活性。3種酶的酶活單位（U·mg-1）定義為：以1 m L反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位（U）；以1 mg蛋白或血紅蛋白中過氧化氫酶（CAT）在 1 s內分解吸光度為0.50～0.55的底物中的過氧化氫相對量為一個酶活力單位；以1 mg蛋白在37 ℃反應l m in，扣除非酶促反應，使反應體系中GSH濃度降低1 μmol·L-1為一個酶活力單位。蛋白含量的測定采用Bradford（1976）法，以牛血清蛋白為標準蛋白。

1.4數據統計

所有實驗數據均采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，采用Sigma Plot 12.5進行圖表繪制。

2　結果與分析

2.1細菌生長對DBP的響應

由圖1可知，添加不同質量濃度DBP，均對B. subtilis D13和E. coli Q5產生了抑制效應。初始4 h為細菌生長遲緩期，DBP的抑制作用較弱，而在進入對數生長期后，細菌生長受到明顯抑制，且抑制作用隨DBP質量濃度的增加而逐漸增強。細菌到達生長平穩期后，各處理組的細菌生長量雖低于對照，但隨時間推移B. subtilis D13生長量呈恢復增加的趨勢（圖1a）。與B. subtilis D13相比，DBP對E. coli Q5的抑制效應更為顯著，且抑制作用隨DBP污染濃度的增加而增強，平穩期細菌生長未出現恢復增加趨勢（圖1b）。

2.2細菌SOD酶活力對DBP的響應

B. subtilis D13和E. coli Q5的SOD酶活力對DBP的響應如圖2。對照組（0 mg·L-1）的SOD酶活力低于DBP處理組，而DBP處理6 h和24 h的SOD活性呈不同程度的增加趨勢。DBP質量濃度為5～40 mg·L-1時，隨著污染濃度的升高，B. subtilis D13的SOD酶活性增加，并在40 mg·L-1處達到最大值（110.73 U·mg-1）；在培養24 h時，B. subtilis D13的SOD活性隨著處理濃度的升高（20～80 mg·L-1）而持續升高，且在80 mg·L-1處仍呈上升趨勢，酶活性為130.86 U·mg-1（圖2a）。DBP處理6 h和24 h時，E. coli Q5的SOD酶活力隨污染濃度的升高而增加，40 mg·L-1處理的SOD酶活力最大，分別為151.18 U·mg-1和147.46 U·mg-1，隨后SOD活性降低（圖2b）。

圖1　DBP污染對B. sub tilis D13（a）和E. coli Q 5（b）生長的影響Fig. 1　Impact of DBP contam ination on the grow th of B. subtilis D13 （a） and E. coli Q5 （b）

2.3細菌CAT酶活力對DBP的響應

由圖3可知，DBP處理的B. subtilis D13和E. coli Q5的CAT活性均高于對照組。處理6 h時，在DBP質量濃度在5～40 mg·L-1范圍內，B. subtilis D13的CAT活性隨處理濃度的升高而增加，之后酶活性隨處理濃度的升高而降低，40 mg·L-1處理CAT活性達最大值（0.62 U·mg-1）；培養24 h時，B. subtilis D13的CAT活性變化趨勢與DBP處理6 h時大致相同，40 mg·L-1處理的CAT活性為0.48 U·mg-1（圖3a）。處理6 h時，E. coli Q5在DBP質量濃度為20 mg·L-1時，CAT活性達到最大值（0.90 U·mg-1），之后CAT活性隨處理濃度升高而降低；而DBP處理24 h時，E. coli Q5的CAT活性無顯著變化（圖3b）。

2.4細菌GST酶活力對DBP的響應

DBP處理6 h時的GST活性增加幅度與24 h時的相比差別較大，在DBP質量濃度為5～40 mg·L-1時，B. subtilis D13的GST活性隨污染物濃度的升高而增加，10 mg·L-1處理GST活性達最大值（0.28 U·mg-1），而處理24 h時，GST活性最大值出現在40 mg·L-1處理組（0.26 U·mg-1）（圖4a）。E. coli Q5 GST活性變化趨勢與B. subtilis D13大致相同，但DBP處理6 h時，GST活性在20 mg·L-1處理出現最大值（0.29 U·mg-1），24 h時GST活性在40 mg·L-1處理出現最大酶活（0.25 U·mg-1），之后GST活性隨污染物濃度的升高而降低（圖4b）。

圖2　B. subtilis D13（a）和E. co li Q5（b）SOD活性的變化Fig. 2　Variation of SOD activities in B. subtilis D13 （a） and E. coli Q5 （b）

圖3　B. subtilis D13（a）和E. coli Q5（b）CAT活性的變化Fig. 3　Variation of CAT activities in B. subtilis D13 （a） and E. coli Q5 （b）

3　討論

微生物是土壤生態系統中不可缺少的重要成分，可參與土壤營養元素循環與多種生物化學反應，在優化土壤生態功能與維持黑土肥力等方面具有至關重要的作用（王志剛等，2012；Graham et al.，2014），同時，微生物的物種和功能多樣性是評價土壤質量的重要指標（Qiu et al.，2012）。最新研究表明，DBP可以干擾黑土微生物的代謝活動，改變微生物的群落結構，并且隨DBP濃度的升高，細菌的多樣性顯著下降（Wang et al.，2016）。DBP污染可使土壤細菌總量和種群發生變化，但對單一細菌種類是否會產生影響，同時單一細菌會對DBP污染脅迫做出何種應答尚不明確。因此，本研究通過監測DBP污染下黑土典型革蘭氏陽性細菌B. subtilis D13和革蘭氏陰性細菌E. coli Q5的生長及抗氧化應激酶活性的變化，探究單一細菌對DBP的響應。本實驗中，經不同濃度DBP處理后，B. subtilis D13和E. coli Q5的生長受到不同程度的抑制，抑制作用與處理濃度呈正相關；DBP對E. coli Q5抑制作用較強，而對B. subtilis D13抑制作用較弱。原因可能是B. subtilis D13為革蘭氏陽性菌，細胞壁比陰性菌的厚，且可產生芽孢，對不利環境有更強的適應性與抗性（Edvantoro et al.，2003）。同時，污染物也可能在微生物的細胞質膜上累積，并降低質膜的流動性（Sun et al.，2006）。因此，DBP可能更易在E. coli Q5中積累并抑制其生長。

微生物在代謝過程中會積累少量的活性氧，正常情況下，活性氧與抗氧化應激酶之間處于動態平衡，但當活性氧過量累積時，抗氧化應激酶就會通過代償機制被激活（Cartw right et al.，2000）。SOD作為O2-專一的清除劑，O2-脅迫應急響應中首先合成的是SOD，并通過歧化反應迅速將O2-轉化為H2O2，隨后CAT對H2O2進行分解，從而消除脅迫效應（燕國梁，2006）。本實驗中，DBP污染可提高細菌SOD和CAT活性，且CAT與SOD具有相同的變化趨勢，呈現低濃度促進高濃度抑制的趨勢，與秦潔芳等（2011）的研究結果相同，但與王志剛等（2015c）的研究結果不盡相同。與CAT對DBP污染的響應結果相比，DMP污染引起CAT活性呈低濃度激活而高濃度抑制的變化趨勢，產生此結果的原因可能與污染物的化學結構不同有關。DMP是PAEs類污染物中結構最簡單、水溶性最高的一類，與DBP相比，更易與細菌接觸并進入胞內而迫使細菌對H2O2脅迫做出應答。GST可催化谷胱甘肽（GSH）與親電性中間代謝產物結合，在減輕氧化脅迫與解毒方面具有重要作用。本實驗中，GST活性隨污染物濃度的升高而增加，且處理6 h的GST活性高于24 h。穆景利等（2009）研究苯并［a］芘對黑鯛肝臟GST活性影響的實驗結果顯示黑鯛肝臟GST活性可在較短的時間內被誘導，且誘導效應在初期高于后期，與本實驗結果一致，說明污染物濃度與處理時間是誘導GST活性的重要因素。與B. subtilis D13相比，E. coli Q5的GST活性較高，也說明DBP對E. coli Q5的脅迫作用較大，E. coli Q5的GST活性對DBP脅迫的響應程度高于B. subtilis D13。

綜上所述，DBP污染對細菌的生長有抑制作用，細菌抗氧化應激酶（SOD、CAT、GST）活性總體表現出低濃度激活而高濃度抑制的趨勢，3種酶協同作用消除因脅迫產生的氧化損傷，對DBP污染做出應答響應，說明DBP污染會引起細菌的氧化損傷，但其損傷機制仍有待進一步研究。

圖4　B. subtilis D13（a）和E. co li Q 5（b）GST活性的變化Fig. 4　Variation of GST activities in B. subtilis D13 （a） and E. coli Q5 （b）

4　結論

DBP污染可抑制細菌的生長，細菌抗氧化應激酶在短期內升高，對DBP污染做出應答響應。由此認為，DBP污染可改變單一細菌的生長狀況，進而影響土壤微生物群落的穩定性。

致謝：誠摯感謝Kui Chen教授在論文寫作過程中提供寶貴意見！

BRADFORD M M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of m icrogram quantities of protein utilizing the principe of protein-dye binding ［J］. Analytical Biochemistry， 72（1-2）： 248-254.

CARTWRIGHT C D， THOMPSON I P， BURNS R G. 2000. Degradation and impact of phthalate plasticizers on soil microbial communities ［J］. Environmental Toxicology and Chem istry， 19（5）： 1253-1261.

DIACONO M， MONTEMURRO F. 2010. Long-term effects of organic amendments on soil fertility： A review ［J］. Agronomy for Sustainable Development， 30（2）： 401-422.

EDVANTORO B B， NAIDU R， MEGHARAJ M， et al. 2003. Change in microbial properties associated with long-term arsenic and DDT contaminated soils at disused cattle dip sites ［J］. Ecotoxicology andEnvironmental Safety， 55（3）： 344-351.

GRAHAM E B， WOEDER W R， LEFF J W， et al. 2014. Do you need to understand microbial communities to predict ecosystem function？ A comparison of statistical models of nitrogen cycling processes ［J］. Soil Biology and Bio-chemistry， 68（1）： 279-282.

HE L， GIELEN G， BOLAN N S， et al. 2015. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in china： a review ［J］. Agronomy for Sustainable Development， 35（2）： 519-534.

KONG S， JI Y， LIU L， et al. 2012. Diversities of phthalate esters in suburban agricultural soils and wasteland soil appeared with urbanization in China ［J］. Environmental Pollution， 170： 161-168.

NIU L， YANG X， CHAO X， et al. 2014. Status of phthalate esters contamination in agricultural soils across China and associated health risks ［J］. Environmental Pollution， 195： 16-23

QIU M H， ZHANG R F， XUE C， et al. 2012. Application of bio-organic fertilizer can control Fusarium wilt of cucumber plants by regulating microbial community of rhizosphere soil ［J］. Biology & Fertility of Soils， 48（7）： 807-816.

SUN J， HUANG J， ZHANG A， et al. 2013. Occurrence of phthalate esters in sediments in Qiantang River， China and inference with urbanization and river flow regime ［J］. Journal of hazardous materials， 248-249：142-149.

SUN Y Y， YU H X， ZHANG J F， et al. 2006. Bioaccumulation， depuration and oxidative stress in fish Carassius auratus under phenanthrene exposure ［J］. Chemosphere， 63（8）： 1319-1327.

WANG J， CHEN G， CHRISTIE P， et al. 2015. Occurrence and risk assessment of phthalate esters （PAEs） in vegetables and soils of suburban plastic film greenhouses ［J］. Science of The Total Environment， 523： 129-137.

WANG J， LUO Y M， TENG Y， et al. 2013. Soil contamination by phthalate esters in Chinese intensive vegetable production systems with different modes of use of plastic film ［J］. Environmental Pollution， 180（3）：265-273.

WANG Z G， LIU S， XU W H， et al. 2016. The microbiome and functions of black soils are altered by dibutyl phthalate contamination ［J］. Applied Soil Ecology， 99： 51-61.

XIA X， YANG L， BU Q， et al. 2011. Levels， distribution， and health risk of phthalate esters in urban soils of Beijing， China ［J］. Journal of environmental quality， 40（5）： 1643-1651.

XU G， LI F， WANG Q， et al. 2008. Occurrence and degradation characteristics of dibutyl phthalate （DBP） and di-（2-ethylhexyl）phthalate （DEHP） in typical agricultural soils of China ［J］. Science of The Total Environment， 393（2）： 333-340.

ZHANG Y， TAO Y， ZHANG H， et al. 2015b. Effect of di-n-butyl phthalate on root physiology and rhizosphere microbial community of cucumber seedlings ［J］. Journal of hazardous materials， 289： 9-17.

ZHANG Y， WANG P， WANG L， et al. 2015a. The influence of facility agriculture production on phthalate esters distribution in black soils of northeast China ［J］. Science of the Total Environment， 506-507：118-125.

穆景利， 王新紅， 林建清， 等. 2009. 苯并［a］芘對黑鯛肝臟GST活性的影響及其與肝臟代謝酶和膽汁代謝產物之間的變化關系［J］. 生態毒理學報， 4（4）： 516-523.

秦潔芳， 陳海剛， 蔡文貴， 等. 2011. 鄰苯二甲酸二丁酯對翡翠貽貝抗氧化酶及脂質過氧化水平的影響［J］. 應用生態學報， 22（7）：1878-1884.

宋長青， 吳金水， 陸雅海， 等. 2013. 中國土壤微生物學研究10年回顧［J］. 地球科學進展， 28（10）： 1087-1105.

王志剛， 胡影， 崔競文. 2015c. 鄰苯二甲酸二甲酯對典型細菌生長和氧化應激酶系的影響［J］. 生態毒理學報， 10（3）： 297-303.

王志剛， 胡影， 徐偉慧， 等. 2015a. 鄰苯二甲酸二甲酯污染對黑土土壤呼吸和土壤酶活性的影響［J］. 農業環境科學學報， 34（7）： 1311-1316.

王志剛， 徐偉慧， 莫繼先， 等. 2012. 東北黑土區大豆根際促生菌群落組成研究［J］. 中國生態農業學報， 20（5）： 592-596.

王志剛， 由義敏， 徐偉慧， 等. 2015b. 黑土微生物豐度和多樣性對鄰苯二甲酸二甲酯污染的響應［J］. 生態環境學報， 24（10）： 1725-1730.

燕國梁. 2006. 活性氧脅迫下Bacillus sp. F26以過氧化氫酶合成為特征的應激響應［D］. 無錫： 江南大學.

朱媛媛， 田靖， 景立新， 等. 2012. 不同城市功能區土壤中酞酸酯污染特征［J］. 環境科學與技術， 35（5）： 42-46.

Response of Bacterial Growth and the Activities of Oxidative Enzymes to Di-n-butyl Phthalate Contamination

HU Ying， WANG Zhigang*， XU Weihui， HU Yunlong， LIU Shuai， YOU Yimin， ZHAO Xiaosong， SU Yunpeng
Institute of Life Science and Agriculture and Forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， China

Di-n-butyl phthalate （DBP） is a ubiquitous organic pollutant in black soil. Because it is widely detected in China's agricultural soil， DBP has been listed as an environmental priority pollutant by China State Environmental Protection Administration. The purpose of the study was to estimate the responses of the growth and activities of oxidative enzymes to DBP with various concentration in B. subtilis D13 （a typical gram-positive bacterium） and E. coli Q5 （a typical gram-negative bacterium） by liquid cultivation and spectrophotometry. The results showed that： （1） the growth of two strains were inhibited by DBP， the effect was more significant at the logarithmic phase. Along with the increase of time， the growth of B. subtilis D13 had recovered， however， E. coli Q5 was not， it appeared more sensitive to DBP than the B. subtilis D13 did. （2） The activities of SOD in the two typical bacteria were increased along with the increase of DBP concentration， which meant that activities of SOD could be correlated to the impact of DBP in B. subtilis D13 and E. coli Q5. （3） Similarly， the trend on the activities of CAT and GST was basically consistent with that on SOD in the two bacteria， that is， the low concentration of DBP could promote enzyme activity， however， and the high concentration of DBP could reduce the activity. The result provides an important basis for further study on the toxicological effect of DBP on microorganisms.

Di-n-butyl phthalate （DBP）； oxidative stress enzyme

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.07.019

X172

A

1674-5906（2016）07-1225-05

黑龍江省青年基金項目（QC2013C032）

胡影（1989年生），女，碩士研究生，研究方向為環境微生物毒理學。E-mail： Mysylviavip@163.com *通信作者

2016-07-02