韭菜單倍體培養技術研究

李冰冰

摘要 為了改變傳統育種方式，采用組培方式培育新品種，是近年來采用的新育種手段。韭菜單倍體培養采用以花藥為培養材料，選擇合適的培養基以及冷處理、暗培養、適宜的溫度、濕度、光照，培育出健壯的瓶苗，繼而移入大田，進行繼代繁殖，從中選育出優良品種。試驗結果表明，可通過花藥培養成功誘導出花粉植株。

關鍵詞 韭菜；組培；單倍體；培養基

中圖分類號 S633.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）09-0067-01

韭菜是百合科多年生草本生植物，適應性強，性喜冷涼，抗旱耐熱，全國各地到處都有栽培。原產亞洲東南部，中國韭菜品種資源十分豐富。韭菜無論從營養價值還是藥用價值，都具有很好的市場。因此，對我國韭菜品種進行組織培養研究，對于提高韭菜的品質與產量具有很重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試韭菜選自大田，選取健壯、無病蟲害的植株。儀器包括75%酒精、0.1%升汞、洗潔精、滅菌三角瓶、無菌水、解剖刀、無菌培養皿、鑷子、剪刀、超凈工作臺。

采摘8月成熟花朵，用醋酸洋紅染色壓片觀察花粉母細胞、四分體時期、單核早中期、單核靠邊期、雙核期。其中單核靠邊期是組織培養中誘導單倍體植株的最佳接種時期。

1.2 培養基配制

增殖培養基：Ms大量+Ms微量+CaCl2+鐵鹽+Ms有機+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂粉5.5 g/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖20 g/L（pH值5.6～5.8，下同）（A）；Ms大量+Ms微量+CaCl2+鐵鹽+Ms有機+6-BA 5.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+檸檬酸60 mg/L+瓊脂粉5.6 g/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖20 g/L（B）。生根培養基：1/2Ms大量+Ms微量+CaCl2+鐵鹽+Ms有機+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+檸檬酸+（GA3+VW+VH）+瓊脂粉6.5 g/L+蔗糖20 g/L（C）；Ms大量+Ms微量+CaCl2+鐵鹽+Ms有機+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+檸檬酸+（GA3+VW+VH）+瓊脂粉5.5 g/L+蔗糖20 g/L（D）。

1.3 試驗實施

1.3.1 材料消毒。用洗衣粉清洗試驗材料，用水沖洗4～5遍，然后放在操凈工作臺上，再用0.1%升汞浸泡10 min，酒精浸泡30 s，再用無菌水沖洗5遍，放入三角瓶中。

1.3.2 接種。取一花蕾，將花序的苞葉除去，取出內部的花序，用消過毒的鑷子和刀片，切去花序的底端1/4，將其接種在不同濃度的培養基上，放入培養皿中，一皿放入50粒左右。

1.3.3 花藥培養條件。一般是光照和黑暗周期交替進行。把培養皿分成2個部分，進行冷處理和暗培養，分別為24 h和48 h，然后放在鐵架臺上，用日光燈進行光照培養。光照強度2 000～3 000 lx，光照時間12 h/d，溫度20～25 ℃。

1.3.4 增殖培養。培養5 h后，花藥逐漸變為黑褐色，20 h左右花藥裂開，并在培養基上長出淡黃色的花粉愈傷組織，30 h以后，愈傷組織會變成黃色的瘤狀物體，其頂端有小綠點出現，這些綠點在3～5 h后形成芽。愈傷組織在增殖培養基上繼續分化，長出1 cm長綠芽時進行第2次轉接，轉入10 cm寬、20 cm高的培養瓶中，長出花苗，在生根培養基上繼續分化，形成根。7 d觀察1次，記錄花藥萌發情況。

1.3.5 繼代繁殖。長成叢生苗后，從培養瓶中取出，放入培養皿中，用剪刀除去叢生苗頂端，剩3～4 cm長叢生苗。繼續在適當培養基上培養，觀察記載生長情況。

1.3.6 大田栽植。出瓶前進行煉苗，揭去培養瓶上的封口膜，在20 ℃左右的溫室中煉苗，7 d后移入盛有基質的營養缽中，室內培養6個月，第2年3月定植在大田，6月進行田間調查，10月底采收。種在大田后，澆水施肥，進行調查研究。測量苗高、葉寬、葉色等，與傳統定植韭菜進行比較，觀察抗病性、抗逆性、病蟲害防治等。灌溉施肥除草，8月成熟以后，不同品種之間進行自交授粉，最后采收種子，以及測定產量，進行區域試驗。計算千粒重，保存資源。

2 結果與分析

試驗結果表明，可通過花藥培養成功誘導出花粉植株，由此說明可通過誘導雄核發育（花藥和小孢子培養）獲得單倍體是韭菜單倍體育種的一條途徑。

常用于組織培養的植物激素有生長素類與細胞分裂素類兩大類[1]。生長素類的主要作用是重新啟動有絲分裂，使已停止分裂的植物細胞恢復分裂能力[2]。常用生長素有IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸），對多數植物材料的培養而言，2，4-D和NAA是生長素中誘導愈傷組織最有效的物質，常用濃度為0.2～3.0 mg/L，愈傷組織誘導的培養基中，高濃度的生長素類結合低濃度的細胞分裂素類對提供胚性愈傷組織的發生是需要的。細胞分裂素的主要作用是促進細胞的分裂與擴大，誘導芽的分化，促進側芽萌發生長[3]，常用的細胞分裂素有6-芐基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）等。細胞分裂素在誘導愈傷組織時，一般要與生長素配合使用，增強生長素的誘導作用和效果，當誘導出胚性愈傷組織以后，進行其增殖（繼代）、分化再生植株時，細胞分裂素起到重要作用。根據實際需要選用適當的細胞分裂素種類[4]。

3 結論與討論

單倍體育種可快速獲得純合自交系，縮短育種年限，具有重要的的研究價值。試驗結果表明，韭菜品種可通過花藥培養成功誘導出花粉植株，說明通過誘導雄核發育（花藥和小孢子培養）獲得單倍體是韭菜單倍體的一條途徑[5-8]。

4 參考文獻

[1] 李勝，李唯.植物組織培養原理與技術[M].北京：化學工業出版社，2007.

[2] 李俊明.植物組織培養教程[M].北京：中國農業大學出版社，2008.

[3] 沈國林，邵愛娟，黃璐琦.三葉木通愈傷組織培養研究[J].中國中藥雜志，2007，32（10）：899-901.

[4] 杜希華，孫秀玲，郝崗平.不同外植體和激素對白菜愈傷組織誘導和生長的影響[J].山東師范大學學報，2008，23（1）：129-133.

[5] 翟麗華.植物生長調節物質對組織培養中不定芽不定根的作用[J].遼寧師專學報（自然科學報），2008，2（2）：97-99.

[6] 高行英，李梅蘭，王婷婷，等.不同抗生素對韭菜根愈傷組織誘導及再生的影響[J].分子植物育種，2013，11（4）：559-565.

[7] 屈二軍，張現青，趙楨，等.韭菜愈傷組織誘導條件優化的研究[J].種子世界，2008（6）：24-25.

[8] 屈二軍，張現青，趙楨，等.植物激素對韭菜愈傷組織誘導的影響[J].安徽農業科學，2008，36（18）：7574.