降解煙堿細菌K9發酵培養基優化研究

王麗萍 岳耀穩 張仲友

摘要 通過單因素實驗法篩選出K9菌株培養基中的最佳碳源、有機氮源、無機氮源和關鍵無機鹽因子，然后用正交試驗確定無機鹽的最佳含量，最后用旋轉中心組合設計及響應面分析法確定培養基中可溶性淀粉、蛋白胨及硝酸銨的最佳濃度，實現培養基的優化。利用Design Expert軟件進行分析，得到各因素的最佳水平值為可溶性淀粉35.0 g/L、蛋白胨5.14 g/L、硝酸銨3.73 g/L，活菌數達到32.4×108 cfu/mL，比優化前提高了4.4倍。通過研究優化出的發酵培養基為今后降解煙堿菌劑的開發利用奠定了基礎。

關鍵詞 煙草節桿菌K9；發酵培養基；降解煙堿菌劑；響應面分析法

中圖分類號 S572；S182 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）09-0289-03

據科學研究分析，煙草煙霧中含有的有毒有害成分高達數百種，包括煙堿、煙焦油、氧化碳、放射性物質等，同時煙草中還含有丙烯醛、氰化鉀、甲醛、鎳、汞、砷、氨、鎘等對人體有致命危害的成分[1-2]。煙堿（尼古丁）是煙草中主要生物堿，卷煙中的尼古丁含量大約為1 mg/支。其具有神經毒性，煙堿對人的神經系統具有刺激作用，同時具有一定的麻痹作用，少量攝入煙堿會產生興奮感，而大量攝入則會影響大腦皮質的神經活動，導致暈眩、嘔吐等不良癥狀，使人的智力減退；煙堿會引起血管的痙攣癥狀，還會改變胃液的酸堿度；煙堿可刺激交感神經，引起血管內膜損害；并且因煙堿會增加血液黏度而使血管收縮，增加發生心臟病的幾率，嚴重者甚至導致煙堿中毒死亡。研究表明，成年人攝入煙堿量為40～60 mg即可致死。若將1支雪茄煙或3支香煙所含有的尼古丁注入人的靜脈內，3～5 min即可致死。因此，煙草制品中的煙堿含量對吸煙者的健康影響較大。與此同時，煙堿還具有令人可畏的成癮性，包括生理成癮性和心理成癮性。生理成癮性是指人體在吸入煙草煙霧后，其中的煙堿經過血液循環進入大腦，刺激腦部受體而釋放出引起大腦興奮的多巴胺，而隨著刺激的增加，受體的敏感性降低，需要越來越多的煙堿的刺激才能產生興奮，導致人體對煙草的依賴性增加。若停止吸煙，則血液中煙堿含量降低，導致興奮度降低，生理快感降低，從而使人體產生一系列諸如頭疼、焦慮、煩躁等不適癥狀，即產生戒斷綜合征，這也是戒煙難度較大的重要原因之一。

本文主要研究煙草節桿菌K9對于煙堿的降解培養基優化條件。煙草節桿菌K9[3]是降解煙堿的高效菌株，用NB培養基培養煙草節桿菌K9時，細胞濃度僅能達到7.4×108 cfu/mL左右，故為提高菌體濃度，對培養基進行相應優化，以獲得高濃度的煙草節桿菌K9。研究以易于細菌生長的改良培養基為基礎，利用單因素實驗法對煙堿節桿菌的碳源、氮源和無機鹽生長強化因子進行篩選，為研制煙草降堿菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

本研究于2015年在安徽皖南煙葉有限責任公司技術中心實驗室進行。供試菌株為煙草節桿菌K9，為云南省煙草農業科學院微生物實驗室保存菌株。

1.2 試驗設計與實施

先利用單因素實驗方法篩選出K9的碳源、氮源和無機鹽離子，再利用響應面法對其培養基進行優化，從而得出培養基最佳成分和濃度。然后進一步用響應面法中的旋轉中心組合設計對其進行優化，以獲得菌株生長的最佳培養濃度。

2 結果與分析

2.1 降堿菌K9在NB培養基中的生長曲線

以活菌數為衡量標準，每隔3 h取樣1次，將樣品稀釋涂平板，培養48 h，檢測活菌數，繪制降堿菌K9在NB培養基中的生長曲線（圖1），可以看出降堿菌K9在NB培養基中連續培養48 h，在0～9 h為菌體的延滯期，菌體生長9 h之后進入對數生長期，菌體濃度迅速增長，42 h左右達到最高，為35×108 cfu/mL，48 h之后進入衰亡期。

2.2 降堿菌K9最適培養基的篩選

2.2.1 不同碳源、氮源對降堿菌生長的影響。不同碳源對降堿菌K9生長的影響結果見表1，可知最佳碳源為可溶性淀粉，菌濃度達到7.30×108 cfu/mL。不同氮源對降堿菌的影響結果見表2，可知最佳有機氮源為蛋白胨，菌濃度達到4.97×108 cfu/mL。最佳無機氮源為硝酸銨，菌濃度達到6.94×107 cfu/mL。而不添加氮源物質時降堿菌的生長情況最差，菌濃度僅為1.00×106 cfu/mL。因此，選定可溶性淀粉、蛋白胨和硝酸銨作為最佳的碳源、氮源進行響應面分析試驗[1-4]。

2.2.2 不同無機鹽離子對降堿菌生長的影響。

（1）無機鹽單因子篩選。通過對無機鹽培養基中的8種無機鹽離子進行逐一篩選發現不同無機鹽離子的有無對降堿菌生長的影響各不相同。從表3可知，當無機鹽離子中無K2HPO4時菌濃度最小，為2.35×103 cfu/mL，說明該無機鹽對降堿菌的生長影響最大，同理分別缺少ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、MnSO4·5H2O時對降堿菌的生長影響較大。而缺少CuSO4和NaCl時對降堿菌的生長基本沒有影響。因此，影響降堿菌生長的無機鹽離子有K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O。然后用正交試驗來進一步確定每種無機鹽的含量[5-9]。

（2）正交試驗確定無機鹽的含量。通過對不同無機鹽離子進行篩選，選取影響降堿菌生長的6種無機鹽離子作為優化因素，每個因素選取5個水平，以菌濃度為優化指標按表4進行L25（56）的正交試驗，結果見圖2。由效應曲線圖可以看出K2HPO4和MgSO4·7H2O 2種物質的含量沒有達到最大值。

（3）2種主要無機鹽進行篩選。選取K2HPO4的含量分別設4個水平，MgSO4·7H2O的含量分別設3個水平如表5所示。然后加入5%的可溶性淀粉和3%的硝酸銨制成100 mL的培養液，并調節pH值至7.2～7.4，裝入250 mL的三角瓶中。滅菌后分別接入8%的50 mL菌懸液在150 r/min的搖床上，28 ℃恒溫培養48 h后，進行菌落計數[10-12]。

由表5中結果可知，2種無機鹽的最佳組合為K2HPO4 0.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.125 g/L，此時菌濃度為3.13×106 cfu/mL，遠大于其他組合。因此，無機鹽離子的最佳濃度為K2HPO4 0.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.125 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 5 g/L，FeSO4·7H2O 0.001 g/L，CaCl2 0.005 g/L。

2.2.3 響應面分析優化煙草節桿菌K9培養基。進行K9菌體濃度多元二次模型方程的建立及檢驗，根據試驗設計進行了20組試驗，其結果見表6。

表6中，x1=（X1-25）/10；x2=（X2-5）/2；x3=（X3-5）/2。

對試驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得K9菌體濃度的二次多項式回歸方程為：

Y=35.14-3.37x1+0.69x2-1.06x3-0.46x1x2-3.09x1x3-0.69 x2x3-2.87x12-5.63x22-1.70x32

式中，Y為預測響應值，x1、x2、x3分別為可溶性淀粉、蛋白胨以及硝酸銨的編碼值。由K9菌體濃度的二次多項式回歸方程得出K9的菌體濃度預測值（表6），方差分析結果見表7。

由表7可知，該模型極顯著（P<0.000 1），失擬項在α=0.1水平上不顯著，模型的校正確定系數RAdj2=0.984 7，表明模型能解釋煙草節桿菌K9菌體濃度響應值的變化。

3 結論與討論

我國烤煙煙堿的平均含量為3%～4%，不同部位的煙葉中上部煙葉的煙堿含量最高，因而在葉組配方中一般因其煙堿含量較高而難以應用。近年來，隨著消費者對自身健康的關注度提高，對于煙草的煙堿含量也有較高的要求。目前卷煙產品正在逐漸向低煙堿含量的方向發展，并且已經出現了許多降低煙草中煙堿含量的技術方法，包括一些農業技術措施及煙葉浸提法等，但是上述降低煙堿含量的技術方法在實施過程中也降低了煙草的綜合品質，而應用微生物降解煙堿技術則具有高效且負面作用小的特點，因此研究利用微生物降低煙葉中的煙堿對于國內煙草業的發展具有重要意義。

本研究通過對菌體在NB培養基中的生長曲線的測定發現在NB培養基中菌體的延滯期時間相對較長，進入對數生長期時間也較長，考慮到菌體的最佳生長時間較長，一般為42 h，為了節省細菌培養所需要的時間以及培養細菌材料的使用，本試驗采用制作菌懸液直接接入改良培養基中對碳氮源進行篩選。本次試驗得到煙堿節桿菌的最佳培養基為無機鹽離子（K2HPO4 0.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.125 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 5 g/L，FeSO4·7H2O 0.001 g/L，CaCl2 0.005 g/L）+35.0 g/L可溶性淀粉+5.14 g/L蛋白胨+3.73 g/L硝酸銨。在優化試驗條件下，得出K9菌體濃度為32.4×108 cfu/mL，比優化前用NB培養基得到的菌濃度（7.4×108 cfu/mL）提高了4.4倍，從而為研究真空冷凍干燥降煙堿菌劑奠定了基礎。

由于煙堿的毒性較高，作為高毒性的化合物，能夠有效降解煙堿的微生物種類不多。根據目前的研究結果，能夠有效降解煙堿的菌類主要包括煙草節桿菌、爭論產堿菌、球形節桿菌、噬煙堿節桿菌、惡臭假單胞菌、纖維單胞菌等，同時有相關報道稱部分蒼白桿菌屬的細菌由于可以破壞芳香化合物的結構而具有降解煙堿的作用，但相關驗證性試驗結果未見報道，其降解煙堿的具體機理、作用及安全效果有待進一步研究。利用部分煙堿降解微生物能夠代謝煙堿的生物特點，可以有效降低卷煙以及生活環境中的煙堿含量，全球各地的科研工作者已經開展了大量的相關研究，包括對代謝煙堿微生物的種類、代謝途徑、分子生物學原理及酶學進行深入研究。自然界中的煙堿代謝微生物能夠以煙堿作為碳源與氮源，其代謝過程是一個復雜的生理、生化過程，主要包括吡啶途徑、吡咯途徑、脫甲基化途徑、吡啶途徑與吡咯途徑的混合途徑等，不同的微生物種類其代謝途徑也不同，并且據最新研究發現仍然存在未知的煙堿代謝途徑，有待進一步探明。微生物對煙堿進行代謝的過程主要在于煙葉的醇化過程，不僅能降低煙堿的含量，減少刺激性，還能夠增加煙草的香氣，從而提高煙草的安全性。因此對降解煙堿微生物的研究意義顯著[13-20]。

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