固相萃取—氣相色譜—串聯質譜法同時測定人體尿液中4種有機磷農藥代謝物

黃夢瑩 王娜 郭欣妍 邱盼子 湯衛國 張尊建

摘要：建立了同時測定尿液中4種有機磷類農藥代謝物的氣相色譜/串聯質譜分析方法。尿液樣品以WCX固相萃取柱富集提取，乙酸乙酯乙腈（70∶30， V/V）再萃取，濃縮干燥，甲苯溶解，N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺衍生化。采用HP5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）程序升溫分離，串聯質譜多反應檢測，內標法定量。通過比較尿樣中代謝物在不同萃取溶劑、固相萃取柱及pH值洗脫液等條件下的回收率，優化了前處理方法。在0.2～200 μg/L范圍內，4種代謝物峰面積與內標峰面積的比值與質量濃度的線性關系良好（R2≥0.992），方法檢出限為0.083～0.667 μg/L，定量限為0.2～2.0 μg/L，平均回收率為54.1%～68.6%，相對標準偏差均小于8.5% （n=6）。本方法穩定、可靠，分析時間短，不需要使用大量有機溶劑，可同時處理大批量樣品，適用于人群有機磷類農藥暴露情況的評估。

關鍵詞 ：固相萃取； 氣相色譜串聯質譜； 有機磷農藥代謝物； 尿液

1 引 言

繼有機氯農藥被全面禁用后，有機磷類農藥（Organophosphorus pesticides，OPs）成為國內目前農業生產上應用最廣泛、使用量最大的農藥[1]。OPs具有易降解、殺蟲效果好、抗性不顯著、殘效期較短的特點，除廣泛應用于農業生產中[2]，還常作為除草劑應用于公園、綠地等公共場所。

OPs進入人體后代謝迅速，蓄積現象不明顯。OPs由于其結構的相似性，進入體內后一般都能代謝成為6種二烷基磷酸酯（DialkylPhosphates，DAP）代謝產物中的1種或幾種，在較短的時間內隨尿排出[3]，主要有機磷農藥代謝產物見表1。除6種二烷基磷酸酯外，OPs還會產生特殊代謝產物，每種特殊代謝產物通常只由特定的1種或幾種OPs代謝產生，如毒死蜱、甲基毒死蜱的特殊代謝產物為3，5，6三氯2吡啶醇（3，5，6TCP），對硫磷、甲基對硫磷的特殊代謝產物為對硝基酚，馬拉硫磷的特殊代謝產物為馬拉硫磷二羥基酸[4]。

近年來，農藥暴露對人體健康的影響受到廣泛關注[6～9]。根據OPs代謝較快的特點，檢測人群尿液樣品中OPs非特異性及特異性代謝物含量可有效評估人體的OPs暴露水平。檢測尿液中OPs代謝物的方法主要有氣相色譜質譜聯用法[10～12]、氣相色譜串聯質譜法[13～15]、液相色譜串聯質譜法[16～18]。液相色譜串聯質譜法前處理較為簡單，但實際應用中靈敏度不高，且基質效應造成的離子抑制比較普遍[19]。提取尿液中DAPs的方法主要有液/液萃取[10～12，15～17]、固相萃取[13，20]、凍干法[14]。本研究采用固相萃取液/液萃取氣相色譜串聯質譜技術建立了人體尿液中3種OPs非特異性代謝產物及1種特殊代謝產物的高靈敏檢測方法，避免了液/液萃取使用乙醚對實驗室造成的安全隱患，實驗時間大幅縮短，凈化效率優于凍干法。本方法為有機磷農藥的人體內暴露研究提供了良好的技術支撐。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Quattra micro GCMS/MS（美國Waters公司）；AG285電子天平（瑞士Mettler公司）； MG2200氮吹儀（日本EYELA公司）；R210旋轉蒸發器（瑞士Buchi公司）；WH3微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司，中國）；Centrifuge C5804離心機、恒溫混勻儀（德國 Eppendorf公司）；MilliQ超純水器（美國Mimpore公司）。

乙腈、乙酸乙酯、甲苯（分析純，南京化學試劑有限公司）；甲醇、甲酸（色譜純，德國Merck公司）；N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA，>97.0%，美國Aldrich公司）。 其它試劑均為國產分析純。

Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）、Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg，3 mL），均購自美國Waters公司。

固相萃取DAPs：準確吸取尿液10.0 mL于100 mL具塞塑料離心管中，加入100 μL濃HCl，渦旋1 min，上樣于Waters Oasis WCX固相萃取柱（柱子提前用6 mL甲醇、6 mL水活化），通過固相萃取小柱的尿液樣品收集于100 mL塑料離心管中。上樣后，干燥，用8 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液置于10 mL具塞比色管中。

液/液萃取TCP：通過固相萃取小柱的尿液樣品中加入適量NaOH，使樣品pH≈7.0，加入2 g NaCl，渦旋至溶解，加入20 mL乙酸乙酯乙腈（70∶30， V/V），渦旋3 min，6000 r/min離心5 min。上清液經過含適量無水Na2SO4的漏斗轉移至雞心瓶中，旋蒸濃縮至2 mL左右。

用移液器將萃取濃縮液移出至含洗脫液的比色管中，40℃水浴中氮吹至完全干燥，比色管中加入0.5 mL甲苯，渦旋1 min，轉移至1.5 mL玻璃小管中，加入10 μL 0.2 mg/L內標DBP，20 μL MTBSTFA，置于90℃恒溫混勻儀中衍生化30 min。

衍生化后的溶液冷卻至室溫，過0.22 μm有機相濾膜，供GCMS/MS分析。

2.3 氣相色譜條件

DB5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：60℃保持2 min，以5℃/min升至90℃，以12℃/min升至160℃，再以10℃/min升至280℃，保持2 min；進樣量1.0 μL；不分流進樣，載氣：氦氣（99.999%），流量：1.0 mL/min，進樣器溫度： 250℃。

2.4 質譜條件

正離子模式的電噴霧電離ESI+，多反應離子監測（MRM），TCP采用選擇離子檢測（SIM）， EI源轟擊能：70 eV，離子源溫度：180℃，傳輸線溫度：250℃，溶劑延遲時間：5.0 min，碰撞氣：高純氬氣，保留時間定性，內標法定量。其它質譜參數見表2。

3 結果與討論

3.1 空白基質的選擇

選擇空白基質時，如采用人工合成尿液進行實驗，雖然本底較為干凈，干擾小，但人工尿液中不含蛋白質，與實際尿液有很大差距，不能有效反映人體實際尿液基質的復雜性。如采用單個個體尿液作為空白基質，有的個體存在較高的本底值，不適合測定方法的建立。因此，本實驗通過篩選不同個體的尿液，選擇本底干擾較小的人體尿液作為本實驗的空白基質。

3.2 前處理條件優化

3.2.1 液/液萃取 大量文獻報道DAPs和TCP提取均采用液/液萃取的方法，故本實驗首先采用液/液萃取的方法提取DAPs和TCP。萃取溶劑見表3，結果見圖2。結果表明，采取液/液萃取法提取DAPs時，同一提取方案對不同代謝物提取回收率差別較大，很難找到平衡方案使各代謝物的回收率均符合要求，TCP的液/液萃取回收率較高。由于TCP的pKa=7.5，近中性，故萃取時將溶液調至pH ≈7，確保萃取時TCP的存在形式為分子態[18]。

3.2.2 固相萃取柱的選擇

目前文獻所報道的DAPs和TCP提取多采用液/液萃取法，固相萃取法的報道較少。本實驗分別考察了親水親油平衡柱（Waters Oasis HLB）、弱陽離子交換柱（Waters Oasis WCX）及弱陰離子交換柱（Waters Oasis WAX）對各代謝物的萃取效果，結果見圖3。

Waters Oasis HLB柱雖然適用范圍較廣，可從各種基質中分離出多種酸性、堿性和中性化合物，但DMTP回收率過高，其它物質則過低。Waters Oasis WAX柱為弱陰離子交換柱，適用于酸性物質， 具有高選擇性，DAPs為酸性（DMP pKa=1.25， DMTP pKa=1.37， DEP pKa=1.37， DETP pKa=1.49），但本實驗發現其對DMP、DEP基本沒有保留，對DMTP、DETP雖有保留，但回收率非常不穩定，不適用于從尿液中提取DAPs，而TCP的pKa近中性，不易被WAX柱吸附。

Waters Oasis WCX柱對DMTP、DEP、DETP、TCP均有保留，且回收率較穩定。Waters Oasis WCX柱為陽離子交換柱，可吸附帶正電的分子。DAPs的pKa較低，呈酸性，實驗中采用強酸酸化并不會使DAPs分子解離，而分子中的硫原子及氧原子含有孤對電子，吸引溶液中的氫質子，從而使DAPs分子質子化，帶正電荷，可被WCX柱吸附。DMP相比于其它的DAPs，由于極性較大，正電性較弱，在WCX柱上基本無保留。WCX柱對除DMP外的DAPs及TCP均有保留，故選其作為固相萃取柱，并對其洗脫條件進行優化。

3.2.3 洗脫條件的優化 在洗脫條件的優化中，分別考察10%甲酸甲醇溶液、20%甲酸甲醇溶液、30%甲酸甲醇溶液，10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果，結果見圖4。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液時，各代謝物回收率在34.9%～77.5%之間（DMP基本無回收），高于20%甲酸甲醇溶液得到的回收率，且較30%甲酸甲醇溶液得到的回收率更為穩定。10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果與10%甲酸甲醇溶甲醇溶液相當，TCP基本無回收。隨著酸度增加，DAPs的回收率基本都是呈先降低再升高的趨勢。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液，回收率可以接受，且較為穩定。

3.3 固相萃取與液/液萃取的比較

采用表3中方案4作為液/液萃取方法，與優化過的固相萃取方法進行回收率的比較，結果見圖5。

對于DMTP， DEP和DETP，固相萃取的回收率和穩定性均高于液/液萃取。對于生物基質樣品分析，方法的穩定性十分重要。液/液萃取提取TCP的回收率和穩定性優于固相萃取。用何種提取方法DMP，結果均不能令人滿意。最終采用固相萃取提取DMTP， DEP和DETP，采用表3中方案4提取TCP。

3.4 衍生化反應

本實驗采用硅烷化試劑N（叔丁基二甲基硅烷基）N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）對目標化合物進行衍生化反應。目標代謝物與衍生化試劑MTBSTFA的反應原理如圖6所示，通過硅烷化作用將叔丁基二甲基硅烷基引入目標代謝物分子中，取代分子中的活性氫。

文獻[5，10，11，20，21]采用五氟溴芐苯（PFBBr）對DAPs進行衍生化，衍生化反應需加入適量K2CO3。與采用PFBBr相比，MTBSTFA的衍生化反應時間較短（PFBBr衍生化反應需16 h[21]），不需要其它試劑參與，不必考慮其它試劑的用量對衍生化效率的影響。

3.5 方法學驗證

3.5.1 標準曲線及線性范圍 向空白尿樣中添加目標代謝物混合標準溶液，按2.2節中前處理方法進行提取、凈化，在優化后的色譜及質譜條件下進樣，繪制工作曲線，記錄各待測物色譜峰面積（As）與內標色譜峰面積（Ar）。以各待測物與內標的峰面積比R （R= As/As）對濃度（C，mg/L）進行線性回歸，確定線性范圍及檢出限、定量限。檢出限和定量限分別以3和10倍信噪比的濃度來確定。DMP在固相萃取柱上基本無保留，其它代謝物制定工作曲線得到的線性方程相關系數均在0.9923～0.9942之間，表明各代謝物在相應的濃度范圍內線性關系良好， 結果見表4。

3.5.2 方法的回收率及精密度 由于無法獲得所分析的代謝物引入叔丁基二甲基硅烷基的標準品，衍生化反應效率無法確定，整個樣品制備過程的絕對回收率無法考察。本研究按2.2節方法同時處理加標與未加標的空白基質，未加標空白基質在衍生化前加入等量標準溶液，由兩者響應的比值計算回收率，設置低、中、高3個添加濃度，結果見表5。生物體液樣本基質較為復雜，分析前需要經過衍生化反應，處理步驟較多，回收率低于基質單一的樣品。

3.5.3 基質效應 采用提取后添加法評定基質效應。按照2.2節方法處理空白尿液基質，衍生化前加入標準品溶液，進樣后所得峰面積記為A組峰面積；純溶劑衍生化前加入標準品溶液，進樣后所得峰面積記為B組峰面積。以A組峰面積與B組峰面積的比值（A/B）考察絕對基質效應，4種代謝物的絕對基質效應在60%～176%之間，故采用基質加標工作曲線消除基質效應的影響。

3.6 氣相色譜質譜條件優化

根據目前已有文獻報道，本研究嘗試了不同的升溫程序。優化后的色譜圖見圖7，各物質峰形良好，分離效果理想。

代謝物衍生化后在EI源中主要的裂解方式見圖7，運用Daughter Scan模式，進行子離子掃描，并對碰撞能量進行優化，以達到較高的靈敏度。3，5，6TCP在正離子檢測方式下，基峰為m/z 256，運用Daughter Scan模式，進行子離子掃描， 結果并未發現響應穩定且較強的碎片峰，這與3，5，6TCP的環狀結構特點較為一致。

3.7 樣品分析

采集居住在農藥廠附近居民的晨尿樣品40份，其中兒童尿液樣品20份，成人尿液樣品20份，按2.2節中的實驗方法進行處理，測定結果見表6。

結果表明，成人尿液樣品DMTP， DEP， DETP， TCP檢出率分別為85%， 90%， 90%， 45%，兒童尿液樣品分別為35%， 75%， 65%， 60%。成人尿液中非特異性代謝物DMTP， DEP， DETP的檢出率均高于兒童，特異性代謝物TCP的檢出率低于兒童。結果表明，居住在農藥廠附近的成人與兒童均有不同程度的有機磷農藥內暴露，呼吸可能是造成有機磷農藥內暴露的重要途徑。以尿液中代謝物作為評估有機磷農藥暴露程度的指標，成人的暴露量大于兒童，這是由于成人的呼吸量較大， 且對農藥的代謝能力較強。不同成人與兒童尿液中有機磷代謝物檢出的差異與其住所位置、膳食結構等都有密切的關系。

4 結 論

建立了固相萃取氣相色譜串聯質譜同時分析制尿液中4種OPs代謝物的方法，定量檢測了人體尿液中4種代謝物含量。本研究采用WCX固相萃取柱，與液/液萃取相比，耗費的有機溶劑更少，耗時更短，適合于大批量樣品的前處理，為研究人群中低劑量OPs農藥暴露情況提供了方法學基礎。

Reference

1 ZHU XiaoLan， CAI JiBao， YANG Jun， SU QingDe. Chinese J. Anal. Chem.， 2005， 33（6）： 821-824

朱曉蘭， 蔡繼寶， 楊 俊， 蘇慶德. 分析化學， 2005， 33（6）： 821-824

2 WU Yan， KANG QingHe， GAO KaiYang， LI ZhiBin. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（5）： 753-757

吳 巖， 康慶賀， 高凱揚， 李志斌. 分析化學， 2009， 37（5）： 753-757

3 Koureas M， Tsakalof A， Tsatsakis A. Hadjichristodoulou. Toxicol Lett.， 2012， 210： 155-168

4 LIU Yong， TANG YingFei， SONG JinFeng， HU ZhiWei. Chinese Journal of Chromatography， 2014， 32（2）： 139-144

劉 永， 唐英斐， 宋金鳳， 胡志偉. 色譜， 2014， 32（2）： 139-144

5 YANG YuLin， RUI ZhengRong， WANG Hong， WANG GuoQuan， CHEN Jia， ZHOU ZhiJun. Chinese J. Health Lab. Technol.， 2003， 13（1）： 24-26

楊玉林， 芮振榮， 王 宏， 汪國權， 陳 嘉， 周志俊. 中國衛生檢驗雜志， 2003， 13（1）： 24-26

6 Engel S M， Wetmur J， Chen J， Zhu C B， Barr D B， Canfield R L， Wolff M S. Environ. Health Perspect.， 2011， 119（8）： 1182-1188

7 CHEN Chao， CHEN GuoQing， GAO ShuMei， KONG FanBiao， LI Run， HUANG QiFeng. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（6）： 718-722

陳 超， 陳國慶， 高淑梅， 孔凡標， 李 潤， 黃奇峰. 光譜學與光譜分析， 2012， 32（6）： 718-722

8 Rauh V， Arunajadai S， Horton M， Perera F， Hoepner L， Barr D B， Whyatt R. Environ. Health Perspect.， 2011， 119（8）： 1196-1201

9 Ding G D， Shi R， Gao Y， Zhang Y， Kamijima M， Sakai K， Wang G Q， Feng C， Tian Y. Environ. Sci. Technol.， 2012， 46： 13480-13487

10 Prapamontol T， Sutan K， Laoyang S， Hongsibsong S， Lee G， Yano Y， Hunter R E， Ryan P B， Barr D B， Panuwet P. Int. J. Hyg. Environ. Health， 2014， 217（45）： 554-566

11 Ueyama J， Kamijima M， Kondo T， Takagi K， Shibata E， Hasegawa T， Wakusawa S， Taki T， Gotoh M， Saito I. J. Chromatogr. B， 2010， 878： 1257-1263

12 Ueyama J， Saito I， Kamijima M， Nakajima T， Gotoh M， Suzuki T， Shibata E， Kondo T， Takagi K， Miyamoto K， Takamatsu J， Hasegawa T， Takagi K. J. Chromatogr. B， 2006， 832： 58-66

13 Alwis G K H D， Needham L L， Barr D B. J. Chromatogr. B， 2006， 843： 34-41

14 Bravo R， Caltabiano L M， Weerasekera G， Whitehead R D， Fernandez C， Needham L L， Bradman A， Barr D B. J. Expo. Anal. Environ. Epidemiol.， 2004， 14： 249-259

15 Hill Jr. R H， Shealy D B， Head S L， Williams C C， Bailey S L， Gregg M， Baker S E， Needham L L. J. Anal. Toxicol.， 1995， 19： 323-329

16 Dulaurent S， SaintMarcoux F， Marquet P， Lachatre G. J. Chromatogr. B， 2006， 831： 223-229

17 Bicker W， Lammerhofer M， Lindner W. J. Chromatogr. B， 2005， 822： 160-169

18 WANG Na， SUN Juan， SHI LiLi， JI GuiXiang， CHEN GuoSong. Chinese Journal of Chromatography， 2013， 31（9）： 903-907

王 娜， 孫 娟， 石利利， 吉貴祥， 陳國松. 色譜， 2013， 31（9）： 903-907

19 Odetokun M S， Montesano M A， Weerasekera G， Whitehead Jr. R D， Needham L L， Barr D B. J. Chromatogr. B， 2010， 878： 2567-2574

20 Alwis G K H D， Needham L L， Barr D B. Talanta， 2009， 77： 1063-1067

21 WU ChunHua， ZHENG LiXing， ZHOU ZhiJun. Fudan Univ. J. Med. Sci.， 2006， 33（4）： 552-555

鄔春華， 鄭力行， 周志俊. 復旦學報醫學版， 2006， 33（4）： 552-555

Abstract A method for quantifying four urinary metabolites of organophosphorus pesticides using gas chromatographytandem mass spectrometry （GCMS/MS） was developed. The metabolites were extracted and enriched from urine samples with WCX solid phase extraction （SPE） cartridges， followed by liquidliquid extraction with ethyl acetateacetonitrile （70∶30， V/V）. The analytes were chemically derivatized with NtertbutyldimethylsilylNmethyltrifluoroacetamide after the derivatives were concentrated by drying and dissolved in phenylmethane. The separation was performed on a HP5MS capillary column （30 m×0.25 mm×0.25 μm） with temperature programming and the detection was performed in multiple reaction monitoring （MRM） mode using GCMS/MS. The internal standard method was used for quantification. The extraction solvents， types of SPE cartridges and eluents were optimized by comparing the sample recoveries under different conditions. The result showed that the calibration curves of four metabolites were linear in the range of 0.2-200 μg/L （R2≥0.992）. The limits of detection （LODs） and the limits of quantification （LOQs） of the four metabolites were 0.083-0.667 μg/L and 0.2-2.0 μg/L， respectively. The recoveries of four metabolites ranged from 54.1% to 68.6% （RSD<8.5%， n=6）. The established method whichs avoid using large amount of organic solvents in liquidliquid extraction is stable， reliable and efficient， and is suitable for the analysis of large amounts of samples. Therefore， the method can be applied to assess the exposure level of organophosphorus pesticide in general population.

Keywords Solid phase extraction； Gas chromatographytandem mass spectrometry； Organophosphorus pesticides metabolites； Urine