整合素連接激酶抑制劑QLT0267對腎小管上皮細胞轉分化的影響*

林智峰，賈林，趙丹，馬莉，唐玉玲，楊銳，楊曉萍

（1.石河子大學醫學院第一附屬醫院腎病科，新疆石河子832008；2.石河子大學醫學院，新疆石河子832008）

整合素連接激酶抑制劑QLT0267對腎小管上皮細胞轉分化的影響*

林智峰1，賈林2，趙丹1，馬莉2，唐玉玲2，楊銳2，楊曉萍1

（1.石河子大學醫學院第一附屬醫院腎病科，新疆石河子832008；2.石河子大學醫學院，新疆石河子832008）

目的觀察不同濃度整合素連接激酶（ILK）抑制劑QLT0267在高糖下誘導人近端腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化（TEMT）的作用。方法體外培養人近端腎小管上皮細胞，分為4組：對照組、高糖組、QLT0267組、高滲組，干預48h。逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測纖維粘連蛋白（FN）mR NA及α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）mR NA的表達，Western blot檢測ILK、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化-蛋白激酶B（P-AKT）及α-SMA的表達，比較組間差異，探討QLT0267對近端TEMT過程的影響。結果①30 mmol/L高糖可以上調人近端腎小管上皮細胞細胞中ILK、P-AKT、FN、α-SMA的表達。②30 mmol/L甘露醇不能引起人近端腎小管上皮細胞細胞中ILK、P-AKT、FN、α-SMA表達變化。③10μmol/L QLT0267抑制高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞細胞AKT、FN及α-SMA的mR NA和蛋白表達。結論①30 mmol/L葡萄糖可以誘導人近端TEMT。②QLT0267通過抑制人近端腎小管上皮細胞細胞中ILK下游AKT的活化，進而抑制FN及α-SMA的表達，10μmol/L QLT0267可以抑制人近端TEMT。

轉分化；近端小管上皮細胞；整合素連接激酶；QLT0267

腎小管上皮細胞是一種穩定細胞，在生理情況下增殖不明顯，但受到炎癥、損傷等刺激時，會發生腎小管上皮細胞肌成纖維細胞轉分化（tubularepithelial-myofibroblasttransdifferentiation，TEMT），TEMT后的肌成纖維細胞（Myofibroblast，MyoF）具有分泌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的能力，引起細胞外基質病理性沉積，打破腎間質中ECM生成與清除間的平衡，最終引發腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）。因此，尋找抑制TEMT過程的作用靶點對保護腎臟功能、延緩慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）進展至關重要。研究發現，糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）TEMT過程中整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）表達增高[1]，而正常情況下，腎小管上皮細胞中僅有少量ILK表達，據此估計ILK與TEMT關系密切。故本研究用ILK特異性抑制劑QLT0267，抑制ILK的活化，觀察其在高糖下誘導TEMT的作用，探討DN過程中TEMT的發病機制，為DN的臨床治療奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料與儀器

1.1.1實驗材料HK-2細胞（上海通派公司），胎牛血清（fetal calf serum，FBS）（以色列BI公司），達爾伯克必需基本培養基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）（無糖）/F12培養基（美國Gibico公司），0.25%胰蛋白酶＋乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（美國Heclon公司），噻唑藍（北京Solarbio公司），QLT0267、二甲基亞砜（上海前塵生物科技有限公司，QLT0267溶劑），兔抗人ILK抗體（英國Abcam公司），兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）抗體（美國Cell Signaling公司），兔抗人磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，P-AKT）抗體（美國Cell Signaling公司），鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（英國Abcam公司），多聚甲醛（武漢博士德生物公司），山羊血清（北京中杉金橋公司），Trizol（美國Invitrogen公司），Thermo逆轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.1.2實驗儀器xMark酶聯免疫檢測儀（美國Bio-Rad公司），顯微鏡（日本Olympus公司），LSM 510 META共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司），XR+凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養及分組①細胞培養：HK-2細胞購置于上海通派公司，復蘇后用含10%FBS的DMEM（無糖）/F12培養液于37℃、5%二氧化碳CO2培養箱中培養，當細胞融合度達75%～80%時，用0.25%胰蛋白酶+EDTA消化，傳代培養，取第2～7代細胞用于實驗。②細胞分組：呂智美等[2]實驗及本課題組前期研究均證實30 mmol/L葡萄糖可以誘導HK-2細胞轉分化；LI等[3]報道，在HKC細胞中，1～10μmol/L QLT0267可以發揮有效的抑制作用。故本實驗分為4組：對照組、高糖組（30 mmol/L葡萄糖）、QLT0267組（30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L QLT0267）、高滲組（30mmol/L甘露醇）作用48 h后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.2逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，R T-PCR）檢測HK-2細胞中ILK、纖維粘連蛋白（Fibronectin，FN）、α-SMA的表達Trizol法提取細胞總RNA，測定HK-2細胞中總RNA含量及純度。在逆轉錄酶催化下合成cDNA，以cDNA為模板進行擴增。FN正向引物：5'-CCTCACCAACCTCACTCCAG-3'，反向引物：5'-TCC CTCGGAACATCAGAAAC-3'，擴增產物117bp；α-SMA正向引物：5'-CCTGACTGAGCGTGGCTATT-3'，反向引物：5'-CAAGGGAGGTAGAGGTAGC-3'，擴增產物134bp；引物由上海生工生物工程有限公司合成，同時擴增管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參照組。α-SMA和FN擴增反應條件：95℃預變性5min，94℃變性30s，59℃/60℃退火30s，72℃延伸30 s，共32個循環，72℃繼續延伸5 min。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像儀中掃描采圖，以各目的基因與GAPDH比值代表各目的基因的相對表達量。

1.2.3Westernblot檢測HK-2細胞中AKT、P-AKT、α-SMA的表達取對數期細胞種板，按上述分組加藥，干預48h后冰上裂解并收集細胞，4℃、12000r離心25 min，提取蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測蛋白濃度，配平后加入5×loading buffer，混勻后100℃、8 min煮沸，蛋白變性，上樣電泳，聚偏二氟乙烯膜轉膜，5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白室溫封閉2h，使用兔抗人單克隆AKT、P-AKT抗體（1∶1 000）或鼠抗人單克隆α-SMA抗體（1∶500）4℃孵育過夜，二抗（1∶20 000）室溫孵育2 h，暗室曝光，凝膠成像和Gel-Pro analyzer分析系統進行灰度分析。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1倒置相差顯微鏡下HK-2細胞形態學觀察

對照組中，HK-2細胞為多邊鵝卵石狀，胞核居中，細胞間連接緊密，呈島嶼狀生長；30 mmol/L葡萄糖使HK-2細胞逐漸由卵圓形、三角形向長梭型轉變，細胞間緊密連接消失，失去原有極性；QLT0267組中，細胞數量較高糖組減少，細胞呈現長卵圓形，胞體略增大，可出現凋亡小體；高滲組中細胞形態較對照組無明顯變化。見圖1。

圖1　倒置相差顯微鏡下HK-2細胞形態（×200）

2.2QLT0267干預48 h對HK-2細胞中ILK表達的影響

Western blot檢測各組ILK表達水平，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=732.525，P=0.000），各組ILK表達水平有差異，對照組中可見ILK條帶較細和弱，進一步兩兩比較結果，①高滲組ILK蛋白相對表達量與對照組比較，差異無統計學意義（t= 1.094，P=0.306）；②對照組與高糖組、QLT0267組ILK灰度比較，差異有統計學意義（t=47.580和29.428，P=0.000），高糖組、QLT0267組ILK灰度較對照組增高；③高糖組ILK表達量與QLT0267組比較，差異無統計學意義（t=1.162，P=0.279）。見圖2。

圖2　Western blot檢測QLT0267干預48 h對各組HK-2細胞中ILK表達的影響

2.3QLT0267干預48h對HK-2細胞中AKT、PAKT表達的影響

Western blot檢測各組AKT、P-AKT表達情況。4組AKT蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異無統計學意義（F=1.839，P=0.181）。各組P-AKT表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=590.355，P=0.000）。對照組中可見P-AKT條帶較細和弱，進一步兩兩結果比較，①對照組P-AKT蛋白相對表達量與高滲組比較，差異無統計學意義（t= 1.584，P=0.152）；②對照組與高糖組、QLT0267組PAKT灰度比較，差異有統計學意義（t=47.580和21.293，P=0.000），高糖組、QLT0267組P-AKT灰度較對照組增高；③高糖組P-AKT表達量與QLT0267組比較，差異有統計學意義（t=4.748，P=0.003），QLT0267組P-AKT表達量較高糖組降低。見圖3。

圖3　Westernblot檢測QLT0267干預48 h對各組HK-2細胞中AKT、P-AKT表達的影響

2.4QLT0267干預48 h對HK-2細胞中FN表達的影響

RT-PCT反應檢測各組FN mRNA的表達，各組FN mRNA表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=227.047，P=0.000）。對照組中可見FN mRNA條帶較細和淺，進一步兩兩結果比較，①對照組FN mRNA相對表達量與高滲組比較，差異無統計學意義（t=1.782，P=0.125）；②對照組與高糖組、QLT0267組FN mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（t=15.616和14.429，P=0.000），高糖組、QLT0267組FN mRNA相對表達量較對照組增高；③高糖組FN mRNA相對表達量與QLT0267組比較，差異有統計學意義（t=9.447，P=0.002），QLT0267組FN mRNA相對表達量較高糖組降低。見圖4。

圖4　RT-PCR反應檢測QLT0267干預48 h對各組HK-2細胞中FN表達的影響

2.5QLT0267干預48 h對HK-2細胞中α-SMA mRNA表達的影響

RT-PCR反應檢測各組中α-SMA的表達，各組α-SMA mRNA表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=40.715，P=0.001）。對照組中可見α-SMA mRNA條帶較細和淺，進一步兩兩結果比較，①對照組α-SMA mRNA相對表達量與高滲組比較，差異無統計學意義（t=0.265，P=0.800）；②對照組與高糖組、QLT0267組α-SMA mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（t=10.844和4.270，P= 0.001和0.005），高糖組、QLT0267組α-SMA mRNA相對表達量較對照組增高；③高糖組α-SMA mRNA相對表達量與QLT0267組比較，差異有統計學意義（t=5.987，P=0.001），QLT0267組α-SMA mRNA相對表達量較高糖組降低。見圖5。

2.6QLT0267干預48 h對HK-2細胞中α-SMA表達的影響

Western blot檢測各組中α-SMA的表達。各組α-SMA蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=869.841，P=0.000）。對照組中可見α-SMA條帶較細和淺，進一步兩兩結果比較，①對照組α-SMA蛋白相對表達量與高滲組比較，差異無統計學意義（t=1.747，P=0.119）；②對照組與高糖組、QLT0267組α-SMA蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（t=46.042和18.585，P=0.000），高糖組、QLT0267組α-SMA蛋白相對表達量較對照組增高；③高糖組α-SMA蛋白相對表達量與QLT0267組比較，差異有統計學意義（t=19.244，P= 0.000），QLT0267組α-SMA蛋白相對表達量較高糖組降低。見圖6。

圖5　RT-PCR反應檢測QLT0267干預48 h對各組HK-2細胞中α-SMA表達的影響

圖6　Westernblot檢測QLT0267干預48 h對各組HK-2細胞中α-SMA表達的影響

3 討論

近年來，隨著對DN過程中RIF研究的不斷深入，TEMT在CKD發展為終末期腎臟疾病過程中的作用受到廣泛關注。研究發現，DN病程發展過程中，高糖可以通過活化TGF-β信號通路誘導TEMT，其特征為腎小管上皮細胞原有表型特征喪失，失去其原有黏附特性，轉化為表達α-SMA的MyoF，而α-SMA的出現是TEMT開始的標志[4]，其表達量與TEMT嚴重程度密切相關[5]。本研究證實，30mmol/L葡萄糖作用48h，可使HK-2中α-SMA表達增高，然而30mmol/L葡萄糖亦是高滲溶液，因此設置30 mmol/L甘露醇組，以鑒別在TEMT過程中，滲透壓增高是否也是誘導HK-2細胞轉分化的獨立因素。實驗結果證實，30 mmol/L甘露醇作用48 h不能使HK-2細胞中α-SMA表達增高，與GU等[6]研究結果基本一致。在該過程中，ILK在高糖組中表達亦增高，佐證ILK可能與DN過程中TEMT關系密切。

ILK是細胞基質粘連的核心組成部分和整合功能的重要調節器[7]，參與細胞黏附、細胞形態變化、調節細胞外基質沉積等多種病理、生理過程[8-9]，如激活和維持靜態毛囊干細胞穩定、防止阻止癌變、抑制乳腺癌干細胞的生長等[10-11]。在腎臟中，高糖可能可以通過引起ILK高表達，誘發足細胞、HK-2細胞轉分化，而大黃酸可能通過下調ILK，延緩該疾病過程[12-13]。因此，尋找有效阻斷ILK信號通路的醫藥制劑對延緩TEMT過程至關重要。

QLT0267是目前公認的ILK特異性抑制劑，通過抑制ILK下游AKT（ser473）磷酸化起效[14]，不改變ILK的表達量，與本研究結果一致。其可能機制為：①P-AKT表達量降低，可以直接抑制細胞分裂、增生；②P-AKT表達下降可以激活糖原合酶激酶3，降低β-鏈結素/T細胞轉錄因子的轉錄活性，抑制細胞增生[14]。在體內QLT0267可以抑制腫瘤細胞生長，抑制瘢痕形成，降低糖尿病大鼠尿白蛋白/肌酐比值[15-18]，參與多種病理生理過程。那么QLT0267在TEMT過程中是否也能起到保護作用呢？

眾所周知，正常情況下，ECM在維持腎臟結構與功能、細胞生長與分化過程中起著非常重要的作用，處于不斷更新和降解的動態平衡中。TEMT后ECM在腎間質內過度集聚，引起RIF。ECM的主要成分是Ⅰ型、Ⅲ型膠原、FN及層黏蛋白等，因此，FN與ILK介導的TEMT關系密切。本研究結果證實，高糖誘導ILK表達增高的同時亦上調FN mRNA，與筆者前期報道內容一致[18]，同時本研究還發現，FN與α-SMA同步表達，即在對照組、高滲組中少量表達，在高糖組中表達量均顯著升高，10μmol/L QLT0267在抑制ILK下游AKT活化的同時，下調FN和α-SMA的表達，證實QLT0267在抑制TEMT的疾病過程具有一定的治療效果。

綜上所述，10μmol/L QLT0267可通過特異性阻止ILK下游蛋白AKT的活化，下調高糖誘導TEMT過程中FN和α-SMA的表達量，延緩TEMT的發展進程，達到一定的治療效果。

[1]SIKKEMA W K,STRIKWERDA A,SHARMA A.Regulation of mitotic cytoskeleton dynamics and cytokinesis by integrin-liked kinase in retinoblastoma cells[J].PLoS One,2014,9(6):DOI: 10.1371/journal.pone.0098838.

[2]呂智美,鄧華聰,諸葛福媛,等.p38 MAPK在高糖誘導的腎小管上皮細胞轉分化中的作用[J].第四軍醫大學學報,2008,18:6.

[3]LI Y J,TAN X Y,DAI C S,et al.Inhibition of integrin-linked kinase attenuates renal interstitial fibrosis[J].J Am Soc Nephrol, 2009,20(9):1907-1918.

[4]RHYU D Y,YANG Y,HA H,et al.Role of reactive oxygen species in TGF-beta1-induced mitogen-activated protein kinase activation and epithelial-mesenchymal transition in renal tubular epithelial cells[J].J Am Soc Nephrol,2005,16(3):667-675.

[5]JIA L,MA XT,GUI B,et al.Sorafenib ameliorates renal fibrosis throughinhibitionofTGF-β-inducedepithelial-mesenchymal transition[J].PLoS One,2015,10(2):DOI:10.1371/journal.pone. 0117757.

[6]GU L,GAO Q,NI L,et al.Fasudil inhibits pithelial-myofibroblast transdifferentiation of human renal tubular epithelial HK-2 cells induced by high glucose[J].Chem Pharm Bull(Tokyo),2013, 61(7):688-694.

[7]SUSHMITA G,JESSICA M,SARA A,et al.ILK:a pseudokinase with a unique function in the integrin-actin linkage[J].Biochemical Society Transactions,2013,41(4):995-1001.

[8]CHEN J,CHEN Y,LUO Y,et al.AstragalosideⅣameliorates diabetic nephropathy involving protection of podocytes in streptozotocin induced diabetic rats[J].Eur J Pharmacol,2014,736:86-94.

[9]JESSICA K,WEISLAWA H,DRAGOWSK A,et al.Using pharmacokinetic profiles and digital quantification of stained tissue microarrays as a medium-throughput,quantitative method for measuring the kinetics of early signaling changes following integrin-linked kinase inhibition in an in vivo model of cancer[J]. Journal of Histochemistry Cytochemisty,2015,DOI:10.1369/0022 155415587978.

[10]MORGNER J,GHATAK S,JAKOBI T,et al.Integrin-linked kinase regulates the niche of quiescent epidermal stem cells[J]. Nat Commun,2015,(Sep 8):8198.

[11]HSU E C,KULP S K,HUANG H L,et al.Function of integrin-linked kinase in modulating the stemness of IL-6-abundant breast cancer cells by regulating γ-secretase-mediated Notch1 activation in caveolae[J].Neoplasia,2015,17(6):497-508.

[12]DAI H Y,ZHENG M,LV L L,et al.The roles of connective tissue growth factor and integrin-linked kinase in high glucoseinduced phenotypic alterations of podocytes[J].J Cell Biochem, 2012,113(1):293-301.

[13]卜凡.ILK、MMP-9在高糖誘導人腎小管上皮細胞轉分化中的表達及意義[D].長沙:中南大學,2009.

[14]EDWARDS L A,WOO J,HUXHAM L A,et al.Suppression of VEGF secretion and changes in glioblastoma multiforme microenvironment by inhibition of intergrin-linked kinase(ILK)[J]. Mol Cancer Ther,2008,7(1):59-70.

[15]ROBERTSON B W,CHELLAIAH MA.Osteopontin induces βcatenin signaling through activation of Akt In prostate cancer cells[J].Exp Cell Res,2010,316(1):1-11.

[16]CHEN T,ZHENG L Y,XIAO W,et al.Emodin ameliorates high glucose induced-podocyte epithelial-mesenchymal transition in-vitro and in-vivo[J].Cell Physiol Biochem,2015,35(4): 1425-1436.

[17]梁振文,李葉揚,林偉華,等.QLT0267抑制整合素連接激酶對人皮膚成纖維細胞生物學特征的影響[J].華損傷與修復雜志:電子版,2013,8(6):18-22.

[18]林智峰,楊曉萍.腎間質纖維化與整合素連接激酶[J].實用醫學雜志,2007,23(15):2442-2444.

（童穎丹編輯）

Effect of integrin-linked kinase inhibitor QLT0267 on tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation of HK-2 cells*

Zhi-feng Lin1，Lin Jia2，Dan Zhao1，Li Ma2，Yu-ling Tang2，Rui Yang2，Xiao-ping Yang1
（1.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Medical College，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832008，China 2.Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832008，China）

Objective To observe the effect of different concentrations of an inhibitor of integrin-linked kinase（ILK）QLT0267 in process of high glucose-induced tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation（TEMT）.Methods The cultured human renal tubular epithelial cells（HK-2）were divided into control group，high-glucose group，QLT0267 group and D-mannitol group，and cultured for 48 hours.RT-PCR was used to test the expressions of fibronectin（FN）mRNA and α-smooth muscle actin（α-SMA）mRNA.The ILK，AKT，p-AKT and α-SMA protein expressions were detected by Western blot.The differences among the groups were observed，and then the role of QLT0267 in the process of TEMT was explored.Results The expressions ofp-AKT，ILK，FN and α-SMA in the HK-2 cells were up-regulated after 30 mmol/L glucose intervention for 48 h.However，30 mmol/L D-mannitol did not change the expression of p-AKT，ILK，FN or α-SMA in the HK-2 cells after 48 h.QLT0267 at a concentration of 10 μmol/L inhibited the mRNA and protein expressions of AKT，FN and α-SMA in the high glucose-induced HK-2 cells.Conclusions Glucose can lead toTEMT in HK-2 cells at a concentration of 30 mmol/L，while 30 mmol/L D-mannitol can not.QLT0267 can prevent activation of AKT in the downstream of ILK，thereby reduce the expression of FN and α-SMA and delay the process of TEMT in the HK-2 cells at concentration of 10 μmol/L.

epithelial-mesenchymal transition；kidney tubular epithelial cell；integrin-linkedkinase；QLT0267

R 692

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.008

1005-8982（2016）17-0039-06

2015-12-29

石河子大學科學技術研究發展計劃基金（No：2013ZRKXYQ-YD16）