臭牡丹總黃酮對A549細胞上皮間質轉化相關蛋白的影響

余　娜，馬思靜，朱克儉*

（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南省中醫藥研究院，湖南長沙410006）

臭牡丹總黃酮對A549細胞上皮間質轉化相關蛋白的影響

余娜1，馬思靜2，朱克儉2*

（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南省中醫藥研究院，湖南長沙410006）

目的觀察臭牡丹總黃酮對A549肺腺癌細胞上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關蛋白的影響。方法構建β-catenin真核過表達載體并轉染A549細胞，將細胞分為空載組、β-catenin過表達組、空載組+臭牡丹總黃酮組、β-catenin過表達+臭牡丹總黃酮組。MTT法檢測不同濃度的臭牡丹總黃酮對A549細胞體外增殖的抑制作用。實時定量PCR檢測各組β-catenin mRNA的表達，Western Blot檢測各組β-catenin、E-Cardherin、Vimentin的蛋白水平。結果MTT顯示A549細胞活力隨臭牡丹總黃酮濃度的增加受到明顯抑制，IC50為2.1 mg/mL。β-catenin過表達組較空載組的β-catenin、Vimentin表達均明顯上調，E-cardherin表達下調。臭牡丹總黃酮在空載組與β-catenin過表達組均能明顯降低βcatenin mRNA與蛋白水平，增加E-cardherin蛋白表達，略微降低Vimentin蛋白表達。結論臭牡丹總黃酮對A549肺癌細胞具有一定的體外抑制增殖作用，其抗腫瘤作用的可能機制是通過調控EMT的相關蛋白從而逆轉β-catenin誘導的EMT現象而起作用。

臭牡丹總黃酮；上皮間質轉化；β-catenin過表達載體；A549細胞

〔Abstract〕Objective To observe the effect of the total flavonoid of Clerodendron bungei Steud（CMD）on the epithelial mesenchvmal transition related proteins in A549 cells.M ethods Building theβ-catenin overexpression vector and transfected A549 cells.The cells can be divied into empty vector group，β-catenin overexpression group，empty vector group +CMD group，β-catenin overexpression+CMD group.The proliferation inhibition of the total flavonoid of Clerodendron bungei Steud with different concentrations on A549 cells in vitro was detected by MTT method.The expression ofβ-catenin mRNA was determined with real-time PCR，and the protein expression ofβ-catenin，E-Cardherin，Vimentin was detected with Western Blot.Results MTT showed that the A549 cells vitality were significantly inhibited with the increasing concentrations of the CMD，the IC50 was 2.1mg/mL.Compared with the empty vector group，the expression ofβ-catenin and vimentin was significantly higher，the E-cardherin was lower inβ-catenin overexpression group.The total flavonoid of Clerodendron bungei Steud can reduce the expression ofβ-catenin，increase the expression of E-cardherin，and slightly reduce the expression of Vimentin protein in empty vehicle and theβ-catenin overexpression groups.Conclusion the total flavonoid of Clerodendron bungei Steud has a certain proliferation inhibition effect on A549 lung cancer cells in vitro.The possible mechanisms is that，it can regulate some related proteins to reverse the EMT phenomenon throughβ-catenin cell signaling.

〔Keywords〕the total flavonoid of Clerodendron bungei Steud；the epithelial mesenchvmal transition；β-catenin expression vector；A549 cell

原發性支氣管肺癌是一種發生于支氣管黏膜及腺體的惡性腫瘤，屬中醫學“肺積”、“肺巖”、“息賁”等范疇，其發病率和死亡率在全球以及我國均居首位［1-2］。其中，腫瘤局部復發和遠處轉移是腫瘤病程發生發展的主要原因，80%以上的肺癌患者確診時癌細胞已發生全身侵犯和轉移，進入疾病晚期。臭牡丹性平，味辛、苦，有“祛風除濕、解毒散瘀”之功，對多種腫瘤具有臨床治療作用，尤以肺癌為佳。臭牡丹對多種腫瘤細胞具有抑制作用，并有一定預防肺癌發生及轉移的作用［3-4］。

上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）現象是腫瘤發生及遠處轉移的重要因素，EMT現象受多條信號通路、轉錄因子以及生長因子的調控［5］。研究顯示β-catenin在胞內穩定的高表達是誘發EMT現象的重要因素，參與腫瘤的侵襲與轉移［6］。本研究采用β-catenin的真核過表達載體轉染人肺癌A549細胞，誘導EMT現象的發生，研究臭牡丹總黃酮對EMT現象標志蛋白E-Cadherin、β-catenin、Vimentin的影響。

1　材料

1.1細胞

人肺腺癌細胞A549購于中南大學高等研究中心細胞庫。β-catenin質粒（pCDNA3.1+載體，AMP抗性），空載體pCDNA3.1+（AMP抗性），由上海交通大學金衛林教授饋贈。

1.2藥物及試劑

總RNA提取試劑RNAiso Plus，逆轉錄試劑RT Master Mix Kit均購自寶生物工程有限公司；SYBR Green熒光染料購自Bio-γad公司；DEPC水購自碧云天生物公司；RT-PCR引物購自Invitrogen公司。引物序列：Anti-β-Catenin（D10A8）、Anti-ECadherin（24E10）RabbitmAb、Anti-Vimentin（D21H3）抗體均購自cell signaling technology。Anti-β-Actin抗體、Western Blot相關試劑均購自Sigma Aldrich。胎牛血清，DMEM培養液，胰酶均購自gibco公司。臭牡丹總黃酮由湖南省中醫藥研究院附屬醫院中藥房提供臭牡丹生藥，經湖南省中醫藥研究院中藥研究所提取，總黃酮含量51%，1 g相當于生藥30 g。批號：20110720。

1.3儀器

金屬浴Grant-bi公司生產；垂直凝膠電泳系統、轉膜系統、化學發光儀XRS+由BIO-RAD公司生產；超凈工作臺，細胞培養箱均由Thermo Scientific公司生產。

2　方法

2.1細胞培養及傳代

人肺癌細胞A549培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃，5%CO2環境下培養。傳代采用0.25%含EDTA的胰酶消化后直接分瓶法。

2.2構建β-catenin真核表達載體轉染A549細胞

制備1DH5α大腸桿菌感受態，并克隆連接有β-catenin目的基因片段的pcDNA3.1過表達載體，經Amp篩選后，選出有外源序列插入的克隆測序。將A549細胞按106個密度接種于6孔板中，待細胞生長至80%-90%，使用Lipo2000 10 uL分別轉染空載體pcDNA3.1（+）/EGFP和β-catenin過表達載體，每孔質粒量4μg，與無血清DMEM混勻后加入6孔板，6 h換有血清DMEM/F12，48 h后用熒光顯微鏡觀察轉染效率。

2.3細胞分組與給藥

細胞共分為4組：轉染空載體組（pcDNA3.1），轉染空載體+臭牡丹總黃酮組（pcDNA3.1+CMD），轉染β-Catenin過表達組（β-Catenin），轉染β-catenin過表達+臭牡丹總黃酮組（β-Catenin+CMD）。用無菌蒸餾水將臭牡丹總黃酮浸膏配成濃度為10 mg/mL的母液，再用無血清培養基配制成2 mg/mL的含藥溶液。待A549細胞生長密度達70%～80%時，加入含藥溶液，置于37℃，5%CO2環境下培養48 h后進行后續實驗。

2.4MTT方法檢測臭牡丹總黃酮對A549細胞增殖的影響

將臭牡丹總黃酮浸膏溶于無菌水中，母液濃度10 mg/mL。取對數生長期的未轉染的人肺腺癌A549細胞株，按5 000個/孔細胞鋪于96孔板。培養6～8 h待細胞充分貼壁后，用含4%FBS的DMEM液配成的不同濃度的臭牡丹總黃酮溶液置換原培養液，每孔200μL，共0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL 12個濃度組，每組6個復孔。作用48 h后，吸去上清，撤去藥物，加入MTT溶液，37℃，5%CO2環境下培養4 h后，吸取板內溶液，加入二甲基亞砜，在OD490 nm處測量各孔的吸光值。

2.5實時定量PCR檢測臭牡丹總黃酮對βcatenin mRNA的影響

按“2.3”分組與給藥的4組A549細胞經PBS清洗后，收集于總RNA提取試劑，經反復吹打破碎后，加入三氯甲烷溶液劇烈震蕩混勻后，靜置5 min后離心，15 min，4℃；小心吸取上層澄清的水相，加入等體積的異丙醇溶液，上下顛倒混勻10下，離心分離總RNA，加入75%乙醇（DEPC水配制）清洗后，用適量的DEPC水溶解。定量后取一定量RNA，加入適量逆轉錄試劑，于37℃轉錄15 min。反應所得cDNA與上下游引物、SYBR Green熒光染料混勻后進行實時定量PCR反應。反應程序為預變性95℃10 min，擴增：95℃15 s，60℃60 s，最大循環數40，引物序列：ACTIN-qPCR-F，CACCATTGGCAATGAGCGGTTCACTIN-qPCR-R，AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT，CTNNB1-qPCR-F，CACAAGCAGAGTGCTGAAGGTG，CTNNB1-qPCRR，GATTCCTGAGAGTCCAAAGACAG。結果采用達到固定熒光閾值的反應循環數表示，采用β-actin作為內參基因，使用2-ΔΔCT法對結果進行分析比較。

2.6Western blot檢測EMT相關蛋白的表達

按2.3分組與給藥的4組A549細胞經裂解液破碎后，收集總蛋白，蛋白樣品與上樣緩沖液混合后，煮沸變性5～10 min。蛋白經SDS-PAGE凝膠分離，120 V，70 min后，轉移至NC膜；載有蛋白質條帶的膜在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉1 h，然后加入含有稀釋一抗（Anti-β-catenin1∶5 000、Anti-E-cadherin 1∶1 500、vimentin 1∶400，內參Anti-β-actin1∶5 000），4℃下振蕩孵育過夜，TBST溶液洗滌后加入含1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）偶聯抗體反應液（相應蛋白的Ⅱ抗、5%脫脂奶粉稀釋），室溫中振蕩孵育1 h。洗滌后，采用ECL化學發光顯示液曝光。

2.7統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。計量數據用“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，并用Sidak法進行多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

3　結果

3.1臭牡丹總黃酮對A549細胞增殖的影響

臭牡丹總黃酮處理A549細胞48 h后，MTT檢測細胞活力顯示，A549細胞活力受到明顯抑制，隨著給藥濃度增加，細胞成活率下降，對細胞抑制作用增強。其半數抑制率IC50為2.1 mg/mL。見表1。

表1　臭牡丹總黃酮各濃度組吸光度A值與抑制率濃度（±s，n=6）

表1　臭牡丹總黃酮各濃度組吸光度A值與抑制率濃度（±s，n=6）

濃度mg/mL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0吸光度1.56±0.25 1.46±0.15 1.43±0.09 1.35±0.12 1.24±0.16 1.05±0.19 0.92±0.23 0.59±0.23 0.40±0.07 0.33±0.03生長抑制率（%）0 6.21 8.01 13.46 20.28 32.3 40.62 61.83 73.77 78.34

3.2臭牡丹總黃酮對β-catenin mRNA的影響

結果顯示，轉染β-catenin過表達載體的細胞的β-catenin mRNA水平明顯增加，而臭牡丹總黃酮可顯著降低β-catenin過表達A549細胞內βcatenin的mRNA水平，也可降低空載組的βcatenin mRNA水平，但差異無統計學意義。見圖1。

3.3臭牡丹總黃酮對EMT相關蛋白表達的影響

β-catenin過表達組較空載組的β-catenin、Vimentin表達明顯上調，E-cardherin表達略有下調，有誘導EMT現象的傾向。臭牡丹總黃酮在空載組與β-catenin過表達組均能明顯降低β-catenin表達，增加E-cardherin表達，略微降低Vimentin蛋白表達，有逆轉EMT現象的傾向。見圖2。

4　討論

圖1　臭牡丹總黃酮對β-catenin mRNA的影響

臭牡丹，性寒，具有“祛風除濕、解毒散瘀、消腫止痛之功”，符合肺癌“化瘀解毒”的中醫治療原則。并具有一定的的補益脾肺腎之力，可治療肺癌肺腎氣虛所致的虛勞咳喘。課題組曾采用淋巴瘤Raji細胞與人肺腺癌A549細胞對臭牡丹提取物的四個不同樣品進行抗腫瘤實驗，發現四個樣品均有不同程度的體外細胞毒作用，在綜合考慮以上四個組分的抗腫瘤強度、提取工藝等因素后，最終確定臭牡丹總黃酮為抗腫瘤有效成分之一，并對其抗腫瘤作用機制進行研究。臭牡丹黃酮類化合物對Lewis肺癌小鼠皮下瘤及轉移瘤、人肺癌細胞A549、H460具有一定的抑制增殖與誘導凋亡作用［7-8］。

圖2　臭牡丹總黃酮對EMT相關蛋白的調控電泳圖

上皮間質轉化（EMT）是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下，向間質細胞表型轉化，同時伴隨有細胞形態與細胞功能的改變［9-10］。EMT現象中具有共同的細胞學機制，上皮屬性蛋白如E鈣黏蛋白（E-eadherin）、角蛋白（Keratin）表達下調，間質屬性蛋白如波形蛋白（Vimentin）、纖維連接蛋白（Fibronectin）表達上升，β-catenin入核，細胞骨架改變。其中E-cardherin維持著上皮細胞表型，是腫瘤侵襲轉移的抑制因子。Vimentin蛋白是EMT中由上皮屬性轉向間質屬性的重要標志物，與腫瘤細胞的侵襲轉移密切相關。β-catenin一方面與E-cardherin結合，形成β-eatenin/E-cadherin復合體，調節細胞間粘附，維持著上皮極性和完整性。另一方面β-catenin可作為轉錄激活因子，調控EMT相關基因的表達，促進腫瘤的進展與轉移［11］。在腫瘤細胞中，β-catenin在細胞核內聚集，胞內穩定的高表達是發生EMT的重要條件。相反，抑制β-catenin的表達則可逆轉細胞的EMT現象［12］。

本研究中采用β-catenin過表達質粒轉染A549細胞，通過對相關蛋白的檢測，發現高表達的βcatenin有誘導EMT現象的作用。臭牡丹總黃酮對A549細胞的體外增殖具有一定的抑制作用，隨濃度的升高抑制率增大。臭牡丹總黃酮對β-catenin過表達組的EMT相關蛋白具有明顯的調控作用，有逆轉EMT現象的傾向，但在空載組無明顯影響。顯示其抗腫瘤的機制有可能是通過逆轉β-catenin誘導的EMT現象而起作用。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］. CA，Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［2］Ferlay J，Shin H R，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008［J］.Int J Cancer，2010，127（12）：2 893-2 917.

［3］胡琦，朱克儉，譚小寧，等.臭牡丹總黃酮對人肝癌HepG2細胞增殖作用的實驗研究.湖南中醫雜志，2014，31（4）：166-168.

［4］朱克儉，張亞利，歐陽劍虹，等.保肺飲預防肺癌的臨床流行病學研究［J］.中國中醫藥科技.1997，4（6）：332-333.

［5］Riccardo F.Thomas B.Wnt/β-catenin signaling in cancer stemness and malignant behavior［J］.Curr Opi Cell Biol，2007，19（2）：150-158.

［6］Kwonseop K，Zifan L，Elizabeth D.Direct evjdence for a role ofβ-catenin/lef-1 signaling pathway in induction of EMT［J］. Cell Bio Inter，2002，26（5）：463-476.

［7］Chen YS，Shen SC，Lin HY.Rutinoside at C7 attenuates the apoptosis-inducing activity of flavonoids［J］.Biochem Pharmacol，2003，66（7）：1 139-1 150.

［8］HUNG Jenyu，HSU Yaling，KO Yingchin，et al.Didymin，a dietary flavonoid glycoside from citrus fruits，induces Fas-mediated apoptotic pathway in human non-small-cell lung cancer cells in vitro and in vivo［J］.Lung Cancer，2010，68（3）：366-374.

［9］Christiansen JJ，Rajasekaran AK.Reassessing epithelial to mese nchymal transition as a prerequisite for carcinoma invasion and metastasis［J］.Cancer Res，2006，66（17）：8 319-8 326.

［10］Klymkowsky MW，Savagner P.Epithelial-mesenchymal transition：a cancer researcher’s conceptual friend and foe［J］.Am J Pathol，2009，174（5）：1 588-1 593.

［11］Valery，Lilia，Francesc.Targeting Wnt/β-catenin pathway in hepatocellular carcinoma treatment［J］.World Journal of Gastroenterology，2016，22（2）：823-832.

［12］Zhao J H，Luo Y，Jiang Y G，et a1.Knockdown ofβ-catenin through shRNA cause a reversal of EMT and metastatic phenotypes induced by HIF-1alpha［J］.Cancer Invest，2011，29（6）：377-382.

（本文編輯 楊瑛）

Effect of the Total Flavonoid of Clerodendron bungei Steud on the Epithelial M esenchvmal Transition Related Proteins in A549 Cells

YU Na1，MA Sijing2，ZHU Kejian2*
（1.Hunan University of Chinese medicine，ChangSha，Hunan 410208，China；2.Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410006，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.05.003

2016-01-25

湖南省自然科學基金項目（14JJ4066）。

余娜，女，講師，在讀博士研究生，從事中藥學教學與科研工作。

*朱克儉，男，研究員，博士研究生導師，E-mail：zkjo0731@263.net。