補腎健骨湯對去卵巢大鼠股骨頸骨小梁微血管和骨密度的影響

王　勇，黃永松，李冬春，胡　擁，王　威

（湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南長沙410005）

補腎健骨湯對去卵巢大鼠股骨頸骨小梁微血管和骨密度的影響

王勇，黃永松，李冬春，胡擁，王威

（湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南長沙410005）

目的探討補腎健骨湯對股骨頸骨小梁微血管及骨密度影響。方法采用切除大鼠卵巢方法建立骨質疏松癥模型，建模成功后隨機分為正常組、假手術組、去勢模型組、雷洛昔芬組、補腎健骨湯組，電鏡觀察股骨頸骨小梁微血管變化以及骨密度檢測股骨頸骨密度。結果（1）正常組微血管規則、連續，骨小梁連續且致密，厚度均勻；去勢模型組微血管變形變窄，斷裂，骨小梁稀疏、萎縮，連續中斷；補腎健骨湯、雷洛昔芬組骨小梁微血管粗細較均勻，骨小梁出現部分斷裂、排列欠規則。（2）假手術組與正常組骨密度無差異（P＞0.05）；去勢模型組骨密度下降明顯，但低于補腎健骨湯組及雷洛昔芬組（P＜0.05）。結論補腎健骨湯可有效改善股骨頸骨小梁微結構并提高骨密度，說明其對絕經后骨質疏松癥的防治及降低骨折發生起到積極作用。

絕經后骨質疏松癥；去卵巢大鼠；骨小梁微血管；骨密度；補腎健骨湯；熟地黃；淫羊藿；骨碎補

〔Abstract〕Objective To investigate the effects of Bushen Jiangu decoction on femoral neck bone trabecular microvascular and its bone mineral density（BMD）in ovariectomized rats.M ethods The osteoporosis model rats were built by their ovaries removed，which were assigned to the normal group，sham-operation group，model group，raloxifene group，Bushen Jiangu decoction group.The changes of femoral neck bone trabecular capillaries were observed by electron microscopy and its BMD was detemined.Results（1）The microvessel of normal group was regular and continuous，bone trabecula was continuous，compact and with uniformity of thickness.The microvessel of ovariectomized models was narrow deformation，fracture，bone trabecular sparse，atrophy and break of continuous.The bone trabecular microvascular of Bushen Jiangu decoction and raloxifene groups was with uniform thickness，bone trabecular appear some fault，arranging owe rules.（2）There is no difference between control group and sham-operation group（P＞0.05）；the ovariectomized rats's BMD was reduced significantly，but it was lower than that of Bushen Jiangu decoctionand raloxifene groups（P＜0.05）.Conclusion Bushen Jiangu decoction can improve the ovariectomized rat`s femoral neck bone structure and its bone mineral density.It is proving that Bushen Jiangu decoction can cure postmenopausal osteoporosis and reuce the rate of fracture.

〔Keywords〕postmenopausal osteoporosis；ovariectomized rats；trabecular microvessel；bone mineral density；Bushen Jiangu decoction；Radix Rehmanniae Preparata；Herba Epimedii；Rhizoma Drynariae

隨著老齡化社會的到來，影響婦女生活質量的絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMO）的發病率越來越高，由其引起的骨折及并發癥日益受到關注。在臨床應用中發現，具有補腎益骨功效的補腎健骨湯能夠有效地改善婦女PMO的癥狀，為進一步明確研究組經驗方“補腎健骨湯”作用機制，本文以去卵巢（去勢）大鼠建立PMO模型，使用掃描電鏡觀察去勢大鼠股骨頸骨小梁微血管變化，骨密度儀檢測大鼠股骨頸骨密度來探討補腎健骨湯對PMO的防治作用。現將方法與結果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物4月齡SPF級未交配健康雌性大鼠60只，體質量（200±20）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供［動物許可證號：SCXK（湘）2011-0003，質量合格證4304702577］。動物購進后適應性喂養一周，于SPF級實驗室喂養，按清潔級標準、分籠同環境飼養，大鼠攝食為無菌標準飼料和蒸餾水。保持飼養環境的通風，光照，溫度23～26℃，相對濕度40%-70%，大鼠籠養，自由攝食、飲水。許可證號：SYXK（湘）2009-0001。

1.1.2藥物補腎健骨湯：熟地黃20 g，淫羊藿15 g，骨碎補15 g，補骨脂10 g，黃芪20 g，白術15 g，茯苓10 g，甘草6 g（由湖南中醫藥大學第二附屬醫院中藥房提供），由中藥制劑室統一煎制，并經過恒溫水浴制成150 mL濃縮藥液，藥液濃度為0.74 g/mL。雷洛昔芬，60 mg×1片，山東宏富達醫藥化工有限公司；用法：每次60 mg搗碎后放入60 mL蒸餾水中制成懸濁液，藥液濃度為1 mg/mL。

1.1.3試劑2%戊巴比妥鈉，科昊生物工程有限責任公司生產（生產編號DH0602）。注射用青霉素鈉，哈藥集團制藥總廠，規格：80萬單位/瓶，批號：A101002008。

1.1.4實驗設備掃描電鏡（PHILIPSXL30W/ TMR）、雙能X線吸收骨密度儀（法國MEDILINK公司，型號：OSTEOCORE）。

1.2方法

1.2.1動物分組基于預實驗研究，將若干雌性大鼠（＞60只）分為正常對照組（12只）、假手術組（12只）、其余雌鼠確認造模成功后隨機分去勢模型組（12只）、補腎健骨湯組（12只）、雷洛昔芬組（12只）。

1.2.2動物造模在SPF實驗中心喂養約一周，待雌鼠適應環境后開始實驗造模。腹腔麻醉根據每只雌鼠的體質量以2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg標準計算劑量；取俯臥位，備皮、消毒、鋪無菌單。取肋骨緣下、后正中線旁開1.5 cm處雙背側約1 cm縱切口，進入腹腔后緩慢牽出卵巢，結扎止血后摘除卵巢，依次縫合關閉傷口。其中，假手術組僅在雙側暴露卵巢后，切除其周圍約1 cm3大小脂肪組織，不結扎輸卵管，不切除卵巢，余手術操作同上。術后使用青霉素5萬U/只肌肉注射3 d抗感染；正常組不處理。

1.2.3動物給藥根據預實驗結果，我們仍通過雌鼠去卵巢造模術后4周行骨密度檢測驗證模型復制成功，然后按每日兩次開始灌胃，共持續8周；正常組、假手術組、去勢模型組另以蒸餾水灌胃。按照人與動物體表面積換算公式計算給藥劑量（大鼠體質量設200 g，人體質量設60 kg），雷洛昔芬組按照6.092 mg/（kg·d）灌胃，補腎健骨湯組以生藥量計算，按照11.270 g/（kg·d）灌胃（以上藥物需按藥液濃度換算后以藥液形式灌胃）。

1.2.4指標觀察骨密度檢測：大鼠處死前行骨密度儀器檢測骨密度，采用骨密度儀小動物掃描軟件精細掃描定位測定一側股骨頸部的骨密度值；掃描電鏡觀察：股骨近端頭頸部供骨區用骨刀獲取約5 mm3大小松質骨標本，后生理鹽水反復沖洗，除去骨表面組織級異物后，注意標示出股骨頸橫斷面為觀察面，以2.5%戊二醛固定1 d以上，后高頻超聲清洗30 min，酒精脫水，再以醋酸異戊酯保存過夜，檢測前以離子濺射儀干燥，噴金，標記編號后在掃描電鏡下觀察股骨頸骨小梁微血管形態及相關結構，記錄后攝片。

1.3統計學處理

應用SPSS 16.0統計軟件包對數據進行統計分析，計量資料用“±s”表示；以正態性分布檢驗和方差齊性檢驗（P＞0.05），再用單因素方差分析進行組間兩兩比較，用LSD檢驗，以P＜0.05差異統計學意義。

2　結果

2.1一般情況

基于預實驗研究，正式實驗雌鼠60只，分為5組：正常組、假手術組、去勢模型組、補腎健骨湯組、雷洛昔芬組；整個實驗過程中無大鼠死亡。

在大鼠飼養過程中，對其活動、飲食及精神狀態等進行觀察。其中正常組在整個實驗過程中，活躍喜動，反應敏捷，毛發順滑光亮，飲食、睡眠良好；假手術組在術后3 d飲食、活動及精神狀態逐漸恢復，與正常組無差異；去勢模型組、補腎健骨湯組、雷洛昔芬組在造模后1個月內出現活動量減少、毛發干枯、少動欲睡等情況。在開始治療灌胃后補腎健骨湯組及雷洛昔芬組的大鼠精神逐漸好轉，反應靈敏，毛發逐漸順滑；去勢模型組大鼠精神仍欠佳，少動嗜睡，反應遲鈍，毛發干枯無光澤。

2.2股骨頸骨小梁微血管觀察

正常組及假手術組的骨小梁微血管表面完整，粗細均勻，連續性可，骨小梁形態對稱，間隙可，骨吸收孔為近圓形；去勢模型組股骨頸骨小梁微血管變形變窄，發生斷裂萎縮，表面部分結構脫落，甚至可見游離物質，骨小梁稀疏、變細變薄，間隙增寬，連續性中斷、殘端增多，有大量微骨折形成；補腎健骨湯、雷洛昔芬組與去勢模型組相比其骨小梁微血管尚規則，表面少許結構脫落，粗細較均勻，連續性尚可，骨小梁結構基本完整，排列欠規則，表面部分微骨裂。（見圖1）。

圖1　大鼠股骨頸骨小梁表面變化（掃描電鏡圖）

2.3股骨頸骨密度測定

假手術組與正常對照組相比，兩組骨密度無統計學意義（P＞0.05）；去勢模型組與正常對照組相比，骨密度減少明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示造模成功；與去勢模型組相比較，補腎健骨湯組、雷洛昔芬組骨密度差異具有統計學意義（P＜0.05）；其中雷洛昔芬組骨密度要略高于補腎健骨湯組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1　各組大鼠股骨頸骨密度比較（±s）

表1　各組大鼠股骨頸骨密度比較（±s）

注：與正常組比△P＜0.05；與去勢模型組比●P＜0.05。

組別正常對照組假手術組去勢模型組雷洛昔芬組補腎健骨湯組n 12 12 12 12 12骨密度（g/cm2）0.211±0.016 0.209±0.015 0.169±0.008△0.207±0.014●0.204±0.011●

3　討論

PMO是婦女的一種全身性骨代謝疾病，見于更年期，目前發病率不斷上升；目前檢測骨質疏松是通過骨密度儀檢測。骨質疏松直接表現是骨密度的降低，嚴重時直接導致骨質疏松性骨折［1］，我國女性一生發生骨質疏松性骨折的危險性（40%）高于乳腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌的總和［2］。發生此類骨折的患者此后一年死亡風險明顯增高；長期的慢性疼痛和功能障礙也很常見；對跌倒的畏懼還可導致臥床、孤獨，并容易患上老年抑郁癥。現代醫學認為，女性絕經后，卵巢功能下降，雌激素迅速減少，從而引起骨吸收和骨重建平衡失調，被公認為是PMO發生的重要原因［3］。雌激素缺乏一方面使破骨細胞過度活躍，骨吸收大于骨形成，影響骨膠原的成熟、轉換和骨礦化；另一方面抑制甲狀旁腺素（PTH）分泌，使1-25（OH）2D3合成減少，造成負鈣平衡，骨礦含量減少，導致骨質疏松癥。從微觀角度看，PMO發生后，骨小梁微血管發生形變、狹窄、萎縮甚至斷裂，骨小梁變細、變形、稀疏，小梁間隙增大，壁變薄。HE Shuzheng［4］研究表明，絕經后婦女雌激素水平下降，血液流變學呈“高黏稠”狀態，造成微循環障礙，導致微血管滲漏和結構破壞。微血管損傷是骨質疏松松質骨超微結構改變的基礎，微血管在骨的生成、重建、修復過程中起著至關重要的作用；超微結構改變必將導致骨質的整體力學強度下降，使微骨裂、微骨折增多。目前西藥治療骨質疏松癥從減少骨吸收或者促進骨形成著手，而PMO的骨松質吸收迅速，骨代謝轉換率高，呈高轉換狀態，治療時可考慮使用骨吸收抑制劑［5］。

中醫學無“絕經后骨質疏松癥”一詞記載，從其臨床主要表現以及發病機制來看，可屬“骨痿”“骨枯”或“腎虛腰痛”范疇。絕經后婦女由于腎氣虛衰，沖任不足，精枯髓少，充養乏源，骨失所養，則骨體枯槁，則發為腰膝酸軟、行走不便的骨痿或骨枯。可見本病的發病關鍵是“腎虛”，其病機主要與肝腎虧損、脾弱血虛、瘀血阻絡有關［6］。中醫藥對PMO的治療著重于整體的調節，緊密圍繞腎主骨生髓的理論，多用補腎法，或在此基礎上加用養肝健脾、補血活血之品治療［7］。大量實驗證實了一些補腎中藥具有與雌激素類似的作用，或被證明含有黃酮類藥植物具有抗骨質疏松作用［8］。黎漢文等［9］以補腎壯骨方（杜仲、熟地黃、鹿角膠、黃芪、當歸、延胡索、牛膝、丹參、補骨脂、茯苓）治療30例PMO患者10個月后，臨床總有效率96%，明顯優于西藥對照組（50%），且雌二醇及BMD明顯增加。

補腎健骨湯治療PMO，方中重用熟地黃為君以滋腎填精，大補真陰。淫羊藿、骨碎補、補骨脂補腎壯陽，強筋壯骨，在補陰之中配伍補陽藥，取“陽中求陰”之義，均為臣藥；黃芪、白術、茯苓益氣健脾，補后天生化之源以充腎精，又防補甚滋膩傷及脾胃，俱為佐藥；甘草調中。諸藥合用共奏補腎益精、強筋壯骨增髓之效。熟地黃作為中藥最為常用的補益品種，被各位醫家廣為選用［10］。現代的研究證實熟地黃具有抗疲勞、益智之效；同時可改善免疫系統和造血系統，增強人的體質。傳統補腎中藥淫羊藿，有研究證實淫羊藿具有雌激素樣作用，在骨質代謝中能降低可誘導骨質疏松發生的風險［11］。劉劍鋼等人研究表明骨碎補能改善患者的骨密度，加強骨的生物力學性，升高血清中正性骨重建指標，如鈣，將有利于骨形成［12］。現代研究補骨脂可能對破骨細胞存在抑制性，而大鼠骨密度、骨鈣含量經過本藥的乙酸乙酯萃取物干預后得到增加，并證實該生藥提取液能促進成骨細胞形成，達到防治骨質疏松目的。《日華子本草》將黃芪功效描述為“助氣，壯筋骨”。研究人員采用體外實驗得出了黃芪能抑制破骨細胞的骨吸收效能，降低骨吸收率，并促進骨形成；為黃芪水提物治療類固醇所致的大鼠骨質疏松獲取積極效果提供了可靠的證據［13］。

本次實驗發現大鼠去卵巢后骨密度明顯下降，骨小梁微血管變形變窄，發生斷裂，骨小梁稀疏萎縮、變細變薄，間隙增寬，連續性中斷，結構破壞明顯，能較客觀地反映PMO模型。使用補腎健骨湯可有效提高骨量，骨小梁微血管形態及連續性尚可，少許游離端，骨小梁結構欠完整，排列基本規則，在改善大鼠股骨頸骨小梁顯微結構及降低骨折發生方面起到積極的作用，且與雷洛昔芬效果無明顯差異。這一結果為補腎健骨湯防治PMO的臨床應用奠定了基礎。從微觀狀態或細胞、分子水平對其作用點、途徑、機制及其影響因素的闡明，將有助于提高臨床應用中藥的科學性和準確性［14］，也是時下（補腎）中藥治療骨質疏松取得進展的理想途徑。

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（本文編輯 李杰）

Effects of Bushen Jiangu Decoction on Femoral Neck Bone Trabecular M icrovascular and its Bone M ineral Density in Ovariectom ized Rats

WANG Yong，HUANG Yongsong，LIDongchun，HU Yong，WANG Wei
（The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410005，China）

R274

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.05.004

2015-10-10

湖南省中醫藥管理局項目（2012106）。

王勇，男，主任醫師、教授，研究方向：骨與關節、骨病的中醫藥防治。