六味地黃湯對5/6腎切除大鼠NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ表達的影響

李巖巖，何澤云*，吳　凡，周艷利

（1.鄭州市第三人民醫院，河南鄭州450000；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；3.廣州市中醫醫院，廣東廣州510130）

六味地黃湯對5/6腎切除大鼠NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ表達的影響

李巖巖1，何澤云2*，吳凡1，周艷利3

（1.鄭州市第三人民醫院，河南鄭州450000；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；3.廣州市中醫醫院，廣東廣州510130）

目的觀察六味地黃湯對5/6腎切除大鼠殘腎轉錄因子-核因子κB（NF-κB）、單核細胞趨化因子（MCP-1）及Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）表達的影響，探討六味地黃湯抑制腎間質纖維化進展的作用機制。方法按照隨機數字表法將60只SD雄性大鼠分為5組：空白組、假手術組、模型組、依那普利組、六味地黃湯組，每組12只，后三組行5/6腎切除術誘導大鼠腎衰模型，假手術組同期手術，但不損及腎臟。造模術后3 d進行灌胃干預。灌胃8周后處死各組大鼠，觀察各組大鼠殘腎組織形態學變化并用免疫組化法檢測大鼠殘腎NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ的表達。結果（1）觀察5/6腎切除大鼠殘腎組織細胞形態學，與模型組相比六味地黃湯、依那普利組可減輕大鼠腎間質損害及纖維化程度；（2）免疫組化半定量分析顯示六味地黃湯組腎皮質的NF-κB、MCP-1及Col-Ⅲ表達均明顯低于模型組（P＜0.05），與依那普利組差異無統計學意義（P＞0.05）。結論六味地黃湯可能通過下調NF-κB、MCP-1及Col-Ⅲ的表達，減少細胞外基質的積聚，減輕炎癥反應和纖維化程度，抑制5/6腎切除大鼠腎間質纖維化進展，可作為慢性腎衰竭的輔助用藥。

六味地黃湯；5/6腎切除；轉錄因子-核因子κB；單核細胞趨化因子；Ⅲ型膠原

〔Abstract〕Objective To observe the effects of Liuwei Dihuang decoction on the expression of nuclear factor kappa B（NF-κB），monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）and collagen type III（Col-Ⅲ）in remnant kidney of 5/6 nephrectmized rats，and to investigate the mechanism of action for Liuwei Dihuang decoction on renal tubulointerstitial fibrosis.M ethods The sixty male Sprapue-Dewley rats were randomly divided into five groups：blank group，sham-operation group，model group，enalapril group and Liuwei Dihuang decoction group，12 rats in each group.The model group，enalapril group and Liuwei Dihuang decoction group adopted 5/6 nephrectomized induced into renal failure model.After 3 days of modeling，the rats were treated by gavage.After 8 weeks，rats were sacrificed，remnant kidney tissue morphological changes were observed and the expression of NF-kB，MCP-1，Col-Ⅲlevels were tested by immunohistochemistry.Results（1）The cell morphology in remnant kidney of 5/6 nephrectmized rats was observed.Compared with model group，renal tubulointerstitial damage and fibrosis was reduced in Liuwei Dihuang decoction and enalapril group；（2）Compared with model group，NF-κB，MCP-1 and Col-III expression level were reduced markedly in Liuwei Dihuang decoction group（P＜0.05），there is no obvious diffrencebetween Liuwei Dihaung group and enalapril group（P＞0.05）.Conclusion Liuwei Dihuang decoction may inhibit the expression of NF-κB，reduce the expression of MCP-1，decrease the accumulation of extracellular matrix，reduce the inflammation and fibrosis and delay the progress of renal interstitial fibrosis，which can be the adjuvant drug of chronic renal failure.

〔Keywords〕Liuwei Dihuang decoction；5/6 nephrectomy；nuclear factor kappa B；monocyte chemoattractant protein-1；collagen type III

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種腎病進展到終末期腎病的基礎，RIF的發生涉及炎性細胞浸潤、腎小管損傷、腎間質成纖維細胞的增殖、細胞外基質過度沉積等過程［1］。單核細胞趨化因子（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）是特異性單核巨噬細胞趨化因子，它借助轉錄因子-核因子κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB），通過其同源受體-CCR2調節RIF的發生，在進行性器官纖維化中起重要作用。NF-κB參與了多種炎癥因子和促纖維化因子的合成，最終導致細胞外基質（extracellular matrix，ECM）效應細胞被激活，產生大量ECM。Ⅲ型膠原（Collagen TypeⅢ，Col-Ⅲ）是ECM的重要成分，其合成和降解的失衡是引起間質纖維化的直接原因之一。5/6腎切除是可以得到逐步進展至腎小球硬化、間質纖維化，最后出現腎功能衰竭的穩定動物模型。六味地黃湯以其安全有效的特點廣泛運用于慢性腎臟病的臨床治療。本文通過探討六味地黃湯對5/6腎切除大鼠殘腎NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ的影響，探討六味地黃湯抑制腎間質纖維化進展的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物健康SD雄性大鼠60只，體質量（200±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。許可證號：SCXK（湘）2013-0004。大鼠飼養環境保持通風、恒溫，每日更換墊料，定期消毒籠具；每天給予12 h燈光照射。

1.1.2主要試劑與儀器兔抗大鼠NF-κBp65單克隆抗體，兔抗大鼠MCP-1單克隆抗體，兔抗大鼠Col-Ⅲ單克隆抗體，PV-9000二步法免疫組化檢測試劑，DAB顯色劑試劑盒均購自北京中杉金橋生物工程有限公司。FINESSE325型石蠟切片機（英國珊頓公司）；Motic BA410T生物顯微鏡（德國）；BM-Ⅷ生物組織包埋機、CS-Ⅵ型攤片烤片機、TS-12A型生物組織自動脫水機（孝感市宏業醫用儀器有限公司）。

1.1.3實驗藥物六味地黃湯（熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。制備方法：先將藥材用相當于藥材2倍的自來水浸泡2 h，武火煮沸后再文火煎熬30 min，將兩煎液混合，于水浴鍋上濃縮為含生藥0.1 g/mL的藥液；馬來酸依那普利片劑（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號H10042451）。

1.2實驗方法

1.2.1分組與造模按照隨機數字表法將大鼠隨機等分為A組（空白組）、B組（假手術組）、C組（模型組）、D組（依那普利組）、E組（六味地黃湯組），每組12只。動物適用性喂養一周后，C、D、E組均按照文獻［2］在無菌條件下行5/6腎切除手術。B組同期行兩次手術，每次僅打開腹腔，暴露腎臟后，關腹。

1.2.2藥物干預A、B、C組予等體積蒸餾水灌胃，1次/d；D組依那普利組以10 mg/（kg·d）溶于等容積蒸餾水灌胃，1次/d。E組予六味地黃湯劑灌胃，劑量為6.75 g/kg生藥，相當于60 kg體質量成人每天75 g生藥的等效劑量，1次/d；共給藥8周。

1.3檢測項目和方法

實驗結束后處死各組大鼠并取出殘腎組織稱重，觀察殘腎大體標本形態，將殘腎組織行冠狀切面，浸入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，制成4μm切片，用于光鏡及免疫組化染色。

1.3.1腎臟病理檢查取石蠟塊，4μm切片后分別進行HE、Masson染色，MOTIC光學顯微鏡下觀察。

1.3.2免疫組化染色采用PV-9000二步法檢測殘腎組織中NF-κB、MCP-1及Col-III的表達，具體操作步驟如下：（1）切片常規脫蠟至水；（2）3%H2O2室溫孵化10 min，蒸餾水漂洗后；（3）熱修復抗原，冷卻后用PBS液漂洗兩次；（4）從微波盒中拿出組織，放入保濕盒中，滴加適量的一抗工作液（約50 uL）分別為：兔抗大鼠NF-κBp65單克隆抗體，兔抗大鼠MCP-1單克隆抗體，兔抗大鼠Col-Ⅲ單克隆抗體；（5）滴加試劑1，室溫孵育20 min，PBS沖洗，5 min× 3次，滴加試劑2，室溫孵育20～30 min，PBS沖洗，5 min×3次；（6）DAB顯色，蘇木素輕度復染5 min到8 min，脫水，透明，中性樹膠封片。采用IPP6.0醫學圖像分析系統，每張切片隨機選取5個不含腎小球和小血管的腎皮質200倍視野，測定累積光密度（IOD）值，對NF-κB、MCP-1及Col-Ⅲ進行圖像分析。

1.4統計學分析

2　結果

2.1動物存活情況

在造模過程及造模后兩周內，模型組4只大鼠、依那普利組2只大鼠、六味地黃湯組2只大鼠死亡。死亡原因有麻醉意外、術中大出血及術后感染等。予以剔除。模型組剩余大鼠8只，依那普利組剩余大鼠10只、六味地黃湯組剩余大鼠10只。

2.2腎組織光鏡檢查

2.2.1HE染色5/6腎切除大鼠殘腎組織HE染色顯示，空白組及假手術組：腎小球結構清晰，腎小管上皮細胞排列整齊。模型組：腎小球明顯縮小、纖維化，腎小管上皮細胞萎縮、脫落，部分管腔不規則、擴張；腎間質可見淋巴細胞浸潤及大量纖維結締組織增生；依那普利組：可見被膜纖維增厚，腎小球輕度縮小，腎小管萎縮；六味地黃湯組：腎小球肥大、小管上皮細胞水腫；腎間質少量纖維結締組織增生及輕度水腫。見圖1。

2.2.2Masson染色5/6腎切除大鼠殘腎組織Masson染色顯示：正常組及假手術組可見腎小球、腎小管結構正常，腎間質未見膠原纖維增生；模型組腎小球內及腎間質均可見大量膠原纖維；依那普利組可見局灶性間質纖維增生，部分小管纖維化；六味地黃湯組可見部分小管纖維化，局灶性間質纖維化，腎間質膠原纖維增加。見圖2。

2.3免疫組化檢測結果

2.3.1NF-κBp65的表達空白組及假手術組可見腎小球及腎間質少量陽性表達；模型組、六味地黃湯組、依那普利組均為陽性表達，以模型組表達最強，依那普利組次之，六味地黃湯組表達最弱，陽性表達主要在皮質區腎小管上皮細胞，胞漿和胞核均見，以胞核表達較強。腎小球陽性表達較弱。見圖3。

2.3.2MCP-1的表達空白組、假手術組可見腎小球及腎間質少量陽性表達；模型組、六味地黃湯組及依那普利組呈陽性表達，活化信號主要見于皮質區腎小管上皮細胞，以胞漿表達較強。見圖4。

2.3.3Col-Ⅲ的表達空白組、假手術組Ⅲ型膠原僅于腎間質及腎小管上皮細胞輕度表達。模型組腎小管間質可見大量陽性表達，與假手術比較表達顯著增強。六味地黃湯組及依那普利組較模型組表達較弱。見圖5。

經IPP（Image-pro Plus）圖像半定量分析，計算切片NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ平均光密度值，進行統計學分析，模型組、六味地黃湯組、依那普利組分別與空白組和假手術組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示造模成功；與模型組比較，六味地黃湯組及依那普利組NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ平均光密度值較模型組明顯減低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），提示六味地黃湯及依那普利均能降低NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ的表達；依那普利組與六味地黃湯組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1　各組大鼠殘腎組織NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ平均光密度的定量分析（±s）

表1　各組大鼠殘腎組織NF-κB、MCP-1、Col-Ⅲ平均光密度的定量分析（±s）

注：與空白組相比，△P＜0.05；與假手術組相比，▲P＜0.05；與模型組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別空白組假手術組模型組依那普利組六味地黃湯組F值P值n 12 12 8 10 10 NF-κB 0.2103±0.0140 0.2417±0.0307 0.3058±0.0099△▲0.2652±0.0089△▲★0.2643±0.0467△▲★5.321＜0.05 MCP-1 0.3003±0.0084 0.3044±0.0067 0.4148±0.0247△▲0.3644±0.0257△▲★★0.3456±0.0201△▲★★4.463＜0.05 Col-Ⅲ0.3429±0.0017 0.3437±0.0025 0.4001±0.0013△▲0.3774±0.0007△▲★★0.3762±0.0007△▲★★9.652＜0.05

圖1　各組腎臟病理學光鏡圖（HE染色，×400）

圖2　各組腎臟病理學光鏡圖（Masson染色，×400）

圖3　各組免疫組化NF-κBp65表達光鏡圖（×200）

圖4　各組免疫組化MCP-1表達光鏡圖（×200）

圖5　各組免疫組化Col-Ⅲ表達光鏡圖（×200）

腎臟疾病進展至慢性腎衰竭的發病機制，至今尚無定論，其共同的通路包括腎臟萎縮、纖維化［3］。腎臟纖維化包括腎小球硬化和間質纖維化。RIF是指各種致病因子如炎癥、損傷等作用下，間質細胞及細胞間質增多，基質蛋白合成增加，基質降解受抑制造成ECM大量堆積。目前認為RIF的主要發生機制為：（1）小管上皮細胞向間充質細胞的轉分化作用；（2）主要效應細胞的激活；（3）局部缺血、缺氧［4］。炎癥損傷是間質纖維化發生發展的重要因素。

3　討論

MCP-1是特異性單核巨噬細胞趨化因子，主要由單核細胞產生，亦可由腎小管上皮細胞產生，它本身具有獨特的信號通路，即借助NF-κB。可以不依賴酪氨酸激酶或者蛋白激酶的途徑，通過其同源受體-CCR2調節RIF的發生，在進行性器官纖維化中起重要作用。單核/巨噬細胞浸潤腎間質，腎小管上皮細胞即被活化，MCP-1分泌增多，趨化炎癥細胞，參與早期炎癥反應。現有的研究表明，MCP－1在多種腎臟疾病中參與了小球和間質的巨噬細胞積聚，而阻斷MCP－1可以減少巨噬細胞積聚并伴腎臟損傷的減輕［5］。

NF-κB作為轉錄因子家族的重要成員之一，參與了多種炎癥因子和促纖維化因子的合成，在免疫炎癥反應、抗凋亡及腫瘤發生中起著重要的作用［6］。并且可以認為是炎性反應的觸發器，活化后會“瀑布式”地誘導機體產生一系列的炎癥因子（包括IL-2、IL-8及TNF等）及組織因子、粘附分子等基因的轉錄，包括MCP-1，發揮著中心環節作用于炎癥反應中。其異常激活可能是腎小球腎炎發生的始動機制之一［7］。一些被NF-κB激活的因子又會反過來進一步誘導NF-κB的激活，生物體內產生級聯放大的炎癥反應。導致ECM效應細胞被激活，產生大量ECM。Ⅲ型膠原是ECM的重要成分，其合成和降解的失衡是引起間質纖維化的直接原因之一。正常情況下Ⅲ型膠原在腎小管上皮細胞及腎間質輕度表達。腎間質積聚的基質蛋白主要為I型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白［8］。在高濾過、高灌注的狀態下或血管內皮細胞發生損失時，促使腎臟產生多種細胞因子，促進腎間質成纖維細胞合成Ⅲ型膠原增加，導致間質纖維化。ECM持續性沉積通過形成纖維瘢痕，破壞正常腎組織，導致腎實質塌陷、腎功能喪失［9］。

中醫理論認為腎間質纖維化的病機主要是虛、瘀、痰濕和濁毒。根據中醫理論著手對補益藥，活血藥，化濕藥，解毒藥亦做過大量實驗，并驗證諸如黃芪、冬蟲夏草、紅花、丹參、大黃等單味藥，黃芪當歸合劑、腎衰保腎湯、歸脾湯、腎康注射液等復方制劑均有一定治療腎間質纖維化的作用［10］。本篇主要從虛著手，選用被后世譽為“補陰方藥之祖”的六味地黃湯。其由熟地黃、山茱萸、懷山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓六味藥組成，主治腎陰虛證。既往研究證實：六味地黃丸（湯）是臨床上治療腎陰虛證型慢性腎小球腎炎的有效方劑［11］。

本實驗的陽性對照藥物依那普利是血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物，可降壓、減少尿蛋白、減少腎小球細胞外基質的蓄積，減輕腎間質纖維化和腎小球硬化，延緩腎損害進展。本實驗發現六味地黃湯組、依那普利組均可減輕5/6腎切除大鼠殘腎組織的病理改變，減少腎間質中膠原纖維面積，抑制NF-κB、MCP-1及Col-Ⅲ的表達。

綜上所述，腎間質NF-κB、MCP-1的高水平可引起ECM效應細胞被激活，Ⅲ型膠原合成和降解的失衡，Ⅲ型膠原增加，導致間質纖維化。六味地黃湯可能通過下調NF-κB、MCP-1及Col-Ⅲ的表達，早期干預炎癥損傷，減少細胞外基質的積聚，抑制腎間質纖維化進展。因而，六味地黃湯可作為慢性腎衰竭的早期輔助用藥。

；

［1］Boor P，Ostendorf T，Floege J.Renal fibrosis：novel insights into mechanisms and therapeutic targets［J］.Nat Rev Nephrol，2010，6（11）：643-656.

［2］SM Shea，J Raskova and A．B．Morrison．A stereologic study of glomerular hypertrophy in the subtotally nephrectmized rat［J］．Am J pathol，1978，90：201．

［3］Kim JH，Ha S，Hwang C，et al.Gene expression profiling of anti-GBM glomerulo nephritis mode：the role of NF-κB in immune complex kidney disease［J］.Kidney Int，2004（66）：826-837.

［4］曾海飛，何澤云，徐琴，等.六味地黃湯對5/6腎切除大鼠MMP-2、TIMP-2表達的影響［J］.湖南中醫藥大學學報，2013，33（7）：13-17.

［5］彭亞軍，張繼波，何澤云，等.六味地黃湯對單側輸尿管結扎大鼠腎間質MCP-1及TGF-B1表達的影響［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2009，10（7）：587-590.

［6］Suzuki K，Wang R，Kubota H，et al．Kinetics of biglycan，decorin and thrombospond in linmercuric chlorides-induced renal tubulointer-stitial Fibrosis［J］．Exp Mol Patho1，2007，9（1）：68-73．

［7］王穎航，潘志，南紅梅，等.腎纖維化的分子病理機制探討［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2006，7（1）：34-37.

［8］李國霞，黃文政，朱小棣.腎疏寧對腎小管間質損害大鼠FN、ColⅢ、PAI-1 mRNA的作用［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2007，8（7）：388-390.

［9］Chen WC，Lin HH，Tang MJ．Regulation of proximal tubular cell differentiation and proliferation in primary culture by matrix stiffness and ECM components［J］．Am J Physiol Renal Physiol，2014，307（6）：F695．

［10］田鋒，張彤，李淑菊.中藥抗腎間質纖維化的研究進展［J］黑龍江中醫藥，2015，44（2）：64-65.

［11］何澤云，徐元美．六味地黃丸治療腎陰虛型慢性腎小球腎炎的臨床研究［J］.湖南中醫學院學報，2004，24（1）：35-37．

（本文編輯 楊瑛）

Effects of Liuwei Dihuang Decoction on NF-κB，MCP-1 and Col-III Expression in 5/6 Nephrectom ied Rats

LI Yanyan1，HE Zeyun2*，WU Fan1，ZHOU Yanli3
（1.The Third Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou，Henan 450000，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China；3.Guangzhou Hospital of TCM，Guangzhou，Guangdong 510130，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.05.005

2015-11-07

湖南省科技廳項目資助（2013SK3099）。

李巖巖，女，碩士，醫師，研究方向：慢性腎臟病的防治。

*何澤云，男，博士，教授，E-mail：hzy2005@zju.edu.cn。