銀屑平丸對BALB/c小鼠銀屑病樣模型血清中IL-17、IL-23表達的影響

謝汶芳，席建元*，李小鵬，彭　丹，溫　柔

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.湖南省瀏陽市人民醫院，湖南瀏陽410300）

銀屑平丸對BALB/c小鼠銀屑病樣模型血清中IL-17、IL-23表達的影響

謝汶芳1，席建元1*，李小鵬1，彭丹1，溫柔2

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.湖南省瀏陽市人民醫院，湖南瀏陽410300）

目的建造BALB/c小鼠背部銀屑病樣模型，探討中成藥銀屑平丸治療銀屑病的可能作用機制。方法選取48只BALB/c小鼠，隨機分為空白組、模型對照組、雷公藤組、銀屑平丸高、中、低劑量組，8只/組。給予除空白組外其余小鼠背部皮膚外涂咪喹莫特軟膏連續8 d，1次/d，建立模型小鼠。末次給藥后，觀察小鼠背部皮膚進行皮損面積和嚴重程度指數（psoriasis area and serenty index，PASI）評分；檢測血清中IL-17、IL-23水平；取背部皮膚組織進行組織病理比較。結果（1）銀屑平丸各組和雷公藤組對銀屑病樣小鼠背部皮膚PASI評分比較無明顯的差異（P＞0.05），而較模型對照組和空白組評分均有明顯的差異（P＜0.05）。（2）各組銀屑病樣小鼠外周血IL-17和IL-23含量明顯高于空白組（P＞0.05）。而銀屑平丸各組和雷公藤組均與模型對照組外周血中含量有明顯的差異（P＜0.05）。（3）銀屑平丸各組和雷公藤組對銀屑病樣小鼠背部皮膚組織病理變化較模型對照組和空白組有明顯差異（P＜0.05）。結論銀屑平丸改善銀屑病模型小鼠的作用機制可能通過抑制IL-17、IL-23，起到減輕小鼠銀屑病樣皮損的發生、發展的作用。

銀屑病；銀屑平丸；IL-17；IL-23；PASI評分

〔Abstract〕Objective The construction of the back psoriasis-like BALB/c mice models discussing Yinxieping pills in the treatment of psoriasis may mechanism.M ethods A total of 48 male BALB/c mice were random ly divided into blank control group，model control group，tripterygium wilfordii group，Yinxieping pills of high，medium and low dose groups，eight mice in each group.Except for blank group，the mice in other groups were given back skin of mice with imiquimod cream for 8 days，1 times/d，the rat models were established.After the last administration，the psoriasis area and severity index（PASI）score of the skin in the back of mice was observed；the levels of IL-23 and IL-17 in serum were detected；the tissue pathology in back skin tissue was compared.Results（1）The PASI score of the skin in the back of psoriasis-like BALB/c mice of Yinxieping pill groups and tripterygium wilfordii group has no significant difference（P＞0.05），and compared with the model control group and blank group，scores had significant differences（P＜0.05）.（2）The contents of IL-17 and IL-23 in the peripheral blood of mice were significantly higher than those in the blank group（P＞0.05）.Compared with model control group，the contents in peripheral blood of the patients in Yinxieping pill groups and triptolide group had significant diffrences（P＜0.05）.（3）The pathological changes of Yinxieping pill group and tripterygium wilfordii group on psoriasis-like mice back skin tissue had obvious changes compared with the model control group and blank control group（P＜0.05）.Conclusion The mechanism of Yinxieping pills improving psoriasis model mice may be by inhibiting IL-17，IL-23，to alleviate the occurrence and development.of psoriasis-like lesions in mice.

〔Keywords〕psoriasis；Yinxieping pills；IL-17；IL-23；PASI score

尋常型銀屑病是一種以T細胞異常活化和浸潤為主要特征的慢性炎癥性皮膚病。銀屑病的病因復雜、機制尚未完全明確，給患者帶來了極大的痛苦。銀屑病研究中，初始T淋巴細胞被活化后CD4+細胞經典的可分為輔助性T細胞1（Th1），輔助性T細胞2（Th2）以及T調節細胞（Treg）三個亞群［1］。近年來新的T細胞亞群Th17也參與銀屑病發病，越來越多的研究支持Th17是銀屑病發病中的關鍵性效應細胞。Th17具有獨立的分化和發育調節機制，在自身免疫性疾病和感染性疾病中發揮重要的調節作用［2］。新的T細胞亞群Th17細胞，可通過IL-23/ IL-17炎性軸發揮作用。本研究主要通過觀察銀屑病樣模型小鼠血清中IL-17、IL-23表達水平，探討銀屑平丸改善小鼠銀屑病模型小鼠的作用機制。

1　材料

1.1實驗動物

選取SPF級BALB/c雌性小鼠48只，體質量18～20 g，均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證：SCXK（湘）2011-0003。溫度18-28℃、濕度40%～70%，噪音在60 dB，小鼠采用普通飼料喂養。

1.2藥物

銀屑平丸（組成：生地黃、牡丹皮、紫草、丹參、白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉、山藥、女貞子、旱蓮草、白鮮皮、甘草），湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫院制劑，批號20140311。將銀屑平丸及雷公藤片用粉碎機全部粉碎成粉末狀，分裝好。同時用蒸餾水溶散。雷公藤多苷10 mg/片（由湖南千金協力藥業有限公司規格）；5%咪喹莫特乳膏（湖北科益藥業股份有限公司生產，規格5 g/支）。

1.3實驗試劑與儀器

IL-17、IL-23的ELISA試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號201312）；10%多聚甲醛（武漢博士德生物有限公司，中國）；酶標儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS）；Shandon325型石蠟切片機（Shandon公司）；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡（LEICA公司產）；MIAS醫學圖像分析系統（北航公司產）。

2　方法

2.1模型制備［3］

BALB/c雌性小鼠局部皮膚外涂5%咪喹莫特乳膏，誘導銀屑病樣小鼠模型。

2.2模型評價

觀察小鼠背部皮損，用校正PASI評分法及小鼠皮損處皮膚HE染色光鏡病理表現評價。

2.3實驗分組與給藥

將48只BALB/c雌性小鼠隨機分為6組，即空白組、模型對照組、雷公藤組、銀屑平丸低、中、高劑量組，每組8只小鼠。銀屑平丸人臨床日用量為45g生藥，按60 kg體質量計算，用藥量為0.75 g/kg，小鼠的用量按低、中、高劑量組，分別為3.25、6.49、12.98 g/kg。雷公藤多苷片，小鼠用量10 mg/kg為臨床等效劑量。除空白組外涂凡士林乳膏，其他各組均外涂5%咪喹莫特乳膏統一予以62.5 mg，1次/d。同時，空白組、模型對照組：予以生理鹽水灌胃；雷公藤組：灌服濃度為10 mg/kg的雷公藤多苷溶液；銀屑平丸高、中、低劑量組分別灌服濃度低、中、高的銀屑平丸溶液，連續8 d。

2.4標本與取材

末次給藥24 h后，各組采取摘眼球取血，每只收集0.8～1 mL血液，取血后立即2 000 r/min離心，10 min，吸取上層血清，-20℃保存，用于細胞因子檢測。并斷頸處死小鼠，取背部皮膚1 cm×1.5 cm大小的皮膚組織，置10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用作病理切片。

2.5觀測指標

2.5.1小鼠一般情況包括小鼠神態、活動度、存活率等。

2.5.2組織病理觀察各組小鼠皮損病理改變，經HE染色觀察皮膚組織病理學改變。銀屑病組織病理改變，表皮突延長，角化不全，表皮棘細胞層增厚，基底細胞核分裂像較多，可見Munro微膿腫，類似銀屑病樣的皮損形成提示造模成功。

2.5.3皮損評分情況觀察各組小鼠給藥8 d后小鼠皮損情況，記錄皮損面積和嚴重程度指數（psoriasis area and severity index，PASI）評分結果。此PASI評分是校正評分，因其皮損面積固定，按紅斑、鱗屑、肥厚程度三者相加總和評分，分為1～5級，對應0～4分。

2.5.4各組小鼠血清中細胞因子IL-17、IL-23的檢測用ELISA法，操作步驟嚴格按照說明書進行，酶標儀檢測。具體步驟：標準品的稀釋與加樣：標準品稀釋五個梯度，每個梯度加樣50μL。加樣：分別設空白孔、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，再加待測樣品10μL。溫育：封板膜封板后置37℃溫育30 min。配液洗滌：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，拍干。加酶：每孔加酶標試劑50μL，空白孔除外。顯色：每孔先加顯色劑A50μL，再加顯色劑B50μL，37℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50μL。測定各孔吸光度（OD值）。計算：用標準物濃度與OD值計算標準曲線的直線回歸方程式，計算出樣品濃度，再乘稀釋倍數，即樣品的實際濃度。

2.6統計學方法

實驗數據采用SPSS 18.0統計軟件進行統計。符合正態分布和方差齊性采用多樣本單因素方差分析，不符合正態分布運用多組連續性資料的秩和檢驗Kruskal-Wallis H檢驗進行統計。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3　結果

3.1小鼠一般情況

在實驗過程中各組小鼠均有小鼠死亡，解剖發現多由于操作不慎，導致小鼠胃破裂、食管出血、小鼠窒息等。各組小鼠存活率比較χ2=2.474，近似P= 0.780，P＞0.05，差別無統計學意義。見表1。

表1　各實驗組小鼠存活情況（只）

3.2模型組BALB/c小鼠皮損隨時間變化情況

實驗過程中，連續外涂5%咪喹莫特乳膏的模型組小鼠，觀察第1、3、5、8天小鼠皮膚變化并記錄，第8天皮損處皮膚出現明顯，紅斑、鱗屑，皮膚肥厚銀屑病樣改變。見圖1。

圖1　模型組BALB/c小鼠外涂5%咪喹莫特后皮膚形態變化圖

3.3組織病理觀察

空白組小鼠皮損表皮平坦，角質層較薄，顆粒層2～4層，棘層為3～5層多角細胞，基底層為單層柱狀細胞。模型組表皮規則性向下延伸，其下部增厚，整體呈棒狀，并伴有不同程度角化過度、角化不全，或角質層中出現Munro氏小膿腫，顆粒層減少或消失，棘層增厚，真皮中有輕度至中度的淋巴細胞浸潤。見圖2。

圖2　各組小鼠皮膚病理光鏡圖（HE染色×200）

3.4BALB/c小鼠模型組實驗校正PASI評分的對比

雷公藤組、銀屑平丸各組分別與模型對照組比較校正PASI評分，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示外涂咪喹莫特的銀屑病樣各組小鼠的PASI評分明顯高于未涂咪喹莫特的空白組PASI評分。而雷公藤組、銀屑平丸組比較校正PASI評分，差異無統計學意義（P＞0.05），提示雷公藤組與銀屑平丸各組的PASI評分相比較未見明顯差異。見表2。

3.5各組小鼠血清中細胞因子IL-17、IL-23的檢測

給藥8 d后BALB/c小鼠血清中IL-17各組進行組間比較，各組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。BALB/c小鼠血清中IL-23各組比較，各組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。空白組、模型對照組與其他各組血清中IL-17、IL-23濃度比較差異有統計學意義（P＜0.05）。雷公藤組與銀屑平丸低劑量組血清中IL-17、IL-23濃度比較差異有統計學意義（P＜0.05）。雷公藤組與銀屑平丸中劑量組、高劑量組血清中IL-17、IL-23濃度比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。銀屑平丸低劑量與高劑量、中劑量組血清中IL-17、IL-23濃度比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表2　給藥8天后小鼠PASI變化情況（±s）

表2　給藥8天后小鼠PASI變化情況（±s）

注：與模型對照組比較，雷公藤組、銀屑平丸低、中、高劑量組Median Test中位數=4，χ2=12.13，近似▲P=0.016，P＜0.05。銀屑平丸低、中、高劑量組比較Median Test中位數=3.5，χ2=0.343，近似●P=0.992，P＞0.05。

組別空白組模型對照組雷公藤組銀屑平丸低劑量組銀屑平丸中劑量組銀屑平丸高劑量組n776765 PASI評分0 5.71±1.13 3.33±1.21▲3.17±1.38▲●3.71±0.98▲●4.20±1.31▲●

表3　各組間IL-17、IL-23含量的變化情況（±s，ng/mL）

表3　各組間IL-17、IL-23含量的變化情況（±s，ng/mL）

注：與空白組比較△P＜0.05，與模型對照組比較*P＜0.05，與雷公藤組比較■P＜0.05。與銀屑平丸中劑量組比較□P＜0.05，與銀屑平丸高劑量組比較◆P＜0.05。

組別空白組模型對照組雷公藤組銀屑平丸低劑量組銀屑平丸中劑量組銀屑平丸高劑量組F值P值n776675 IL-17 151.0±23.31 267.7±21.34△201.0±13.40* 229.9±18.92*■□◆186.4±12.00* 182.0±14.67* 34.39 P＜0.05 IL-23 173.9±22.13 304.8±18.96△204.9±18.78* 237.8±20.68*■□◆203.3±19.82* 210.1±16.69* 38.26 P＜0.05

4　討論

銀屑病中醫稱之為“白疕”、俗稱“牛皮癬”。本病呈周期性反復發作，嚴重影響人們的身心健康，席建元主任醫師認為尋常型銀屑病的發病與“血熱”、“熱毒”、“血瘀”、“陰虛”等有關，血熱為其基本病機，血熱易傷陰化燥，肌膚失養，因此，把“涼血養陰，活血解毒”法作為尋常型銀屑病的治療原則，研制成銀屑平丸。該方由生地黃、牡丹皮、紫草、丹參、白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉、山藥、女貞子、旱蓮草、白鮮皮、甘草。銀屑平丸重用生地黃甘、苦、寒為君藥，以清熱涼血解毒，養陰生津；以白花蛇舌草、半枝蓮清熱解毒，而赤芍、牡丹皮涼血活血養陰，紫草解毒透疹，丹參、大青葉清熱活血化斑，與君藥同用，清熱涼血活血消斑，共為臣藥；女貞子、旱蓮草、麥冬養陰生津潤燥與山藥健脾潤燥合用共為佐藥；白鮮皮清熱祛風止癢引經達表，甘草清熱解毒兼調和諸藥，為使藥。本方藥性偏涼，以清熱涼血解毒為主，兼以活血、養陰。使全方表里兼顧，涼血而不留瘀。在前期研究中已證明銀屑平丸能降低銀屑病患者血清IL-8水平，改善臨床癥狀［4］；并能夠降低TNF-a和VEGF表達水平，對免疫機制進行調節［5］，本文將進一步探討其作用機制。

西醫學對本病的病因和發病機制進行了大量的研究，發現其發病與角質細胞角化過度、角化不全、真皮淺層血管擴張、迂曲，通透性增加，新生血管形成有關。近年來發現銀屑病發病過程中，T細胞活化起關鍵性作用，活化T細胞產生的細胞因子刺激表皮增殖的同時增殖角質形成細胞釋放其他細胞因子增強活化T細胞的作用［6］。活化T細胞產生細胞因子放大這種作用，使銀屑病慢性、反復遷延。Th17是新發現的T細胞亞群，它參與銀屑病發病，并且可以產生特殊IL-17，還能分泌IL-22、IL-21、IL-6、腫瘤壞死因子等細胞因子，而細胞因子涉及免疫和炎癥的每一個環節。樹突狀細胞在外界刺激下分泌IL-23分子，它可誘導Th17細胞增殖、活化并分泌IL-17、IL-22等多種細胞因子［7］，這些細胞因子募集中性粒細胞［8］，誘發銀屑病樣炎性損傷，稱為IL-23/ IL-17炎性軸。它在銀屑病發病機制中的作用是近年研究的熱點。

IL-17最主要來源于活化T淋巴細胞，并且是活化T細胞的前炎性細胞因子，是T細胞誘導炎癥反應的早期啟動因素，也是Th17的標志性細胞因子。IL-17具有強大的致炎性，它可以誘導上皮細胞、內皮細胞、纖維原細胞和巨噬細胞產生炎癥細胞因子IL-6、急性反應蛋白、粒-巨細胞刺激因子（GCSF）和前列腺素E2等；還可以協同IFN-γ通過人類角質形成細胞增加前炎癥細胞因子的產生，因此增加T細胞向表皮的聚集。因為其強大的致炎性，有可能參與中性粒細胞在銀屑病皮損中浸潤（血管周圍中性粒細胞的侵潤和表皮中性粒細胞微潰瘍的形成）。

IL-23是IL-12分子家族中的一員。大部分學者認為IL-23源自于單核/巨噬細胞和B細胞，樹突細胞也可合成。研究表明IL-23是新發現的促炎性細胞因子，對T細胞有密切作用，它能誘導CD4+記憶T細胞產生IFN-γ。IL-23還能促進T細胞亞群應答產生IL-17或IL-17相關的細胞因子如IL-17A及IL-17F。IL-23也能通過DC來活化和調節T細胞依賴的免疫應答。IL-23本身有抗腫瘤、抗感染的作用。

IL-17和IL-23與銀屑病發病有密切關系。IL-23可以促進Th17的應答，產生IL-17或IL-17相關因子，也是Th17的調節因子。IL-23不參與Th17細胞的早期分化，但在Th17表型穩定、存活及增殖等方便起重要作用［9］，產生從而形成了IL-23/IL-17免疫應答途徑。Antonella等［10］提出IL-23/IL-17軸在銀屑病的發病機制中發揮重要作用。有研究表明銀屑病患者皮損區IL-17表達水平明顯高于非皮損區，外周血中IL-17水平明顯高于健康對照組，且與IL-17的水平與疾病嚴重程度相關［11］。銀屑病與IL-23的相關性研究表明，銀屑病患者皮損區角質形成細胞核真皮中IL-23 mRNA的表達高于非皮損區及正常人［12］。

本實驗通過對銀屑病樣小鼠模型外周血中IL-17和IL-23這兩個白介素因子的研究發現，這兩個細胞因子在銀屑病樣小鼠模型的血清中存在明顯的異常升高，而銀屑平丸可以明顯降低銀屑病樣小鼠模型血液中這兩個因子的含量，且IL-17、IL-23與銀屑病樣小鼠模型的PASI評分呈正相關，此結果提示，銀屑平丸可能是通過抑制IL-23、IL-17細胞因子，影響IL-17/IL-23炎性軸而達到治療銀屑病。且可能還有其它影響因素發揮作用。對于銀屑病的具體的作用機制還有待于進一步研究。

［1］Murphy K M，Reiner S L．The lineage decisions of helper T cells［J］．Nat Rev Immunol，2002，2：933-944.

［2］Tesmer LA，Lundy SK，Sarkar S，eta1．Thl7 cells in human disease．Immunol Rev［J］.2008，223（1）：87-113．

［3］胡堅，楊閏平，汶春苗等.NLRP3炎癥小體在咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣模型中的表達及芥菜籽對其的影響［J］.南方醫科大學學報，2013，33（9）：1 394-1 398.

［4］席建元，陶璇，李小鵬等.銀屑平丸治療尋常型銀屑病血熱證的臨床觀察及對血清IL-8的影響［J］.湖南中醫藥大學學報，2012，32（1）：51-53.

［5］李小鵬，席建元，謝汶芳，等.銀屑平丸對豚鼠銀屑病樣模型VEGF和TNF-α表達的影響［J］，中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2014，13（5）：294-297.

［6］Griffles CE，Barker JN．Pathogenesis and clinical features of psoriasis［J］.Lancet，2007，370：263-271．

［7］Murphy K M，Reiner S L．The lineage decisions of helper T cells［J］．Nat Rev Immunol，2002，2：933-944.

［8］Murphy K M，Reiner S L.The lineage decisions of helper T cells［J］．Nat Rev Immunol，2002，2：933-44．

［9］Thakker P，Leach M W，Kuang W.et al.IL-23 receptor is critical in the Induction But not in the effector phascof experiental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Immunol，2007，178：289-298.

［10］Antonella DC，Paola DM，Frank ON.The IL-23/Th17 axis in the immuno pathogenesis of psoriasis［J］.J Invest Dermatol，2009，129：1 339-1 350.

［11］Arican O，Aral M，Sasmaz S，et al.Serum levels of TNF-alpha，IFN-gamma，IL-6，IL-8，IL-12，IL-17 and IL-18 in patients with active psor iasis and correlation with disease severity［J］.Mediators Inflamm，2005，5：273-279.

［12］Piskin G，Sylva-Steenland RM，Bos JD，et al.In vitro and in situ expre ssion of IL-23 by keratinocytes in healthy skin and psoriasis lesi ons；enhanced expression in psoriatic skin［J］.J Immunol，2006，176：1 908-1 915.

（本文編輯 楊瑛）

Effects of Yinxieping Pills on IL-17，IL-23 Expression of in Serum of Psoriasis-like BALB/c M ice M odels

XIE Wenfang1，XI Jianyuan1*，LI Xiaopeng1，PENG Dan1，WEN Rou2
（1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China；2.The People's Hospital of Liuyang City，Liuyang，Hunan 410300，China）

R285.5；R758.63

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.05.007

2015-10-20

謝汶芳，女，碩士，醫師，從事中醫皮膚病臨床工作。

*席建元，男，主任醫師，E-mail：xijianyuan2010@126.com。