二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的建立

谷　捷，李　鑫，余黃合，，王寶新，黃惠勇，曾　嶸*，蔡　雄，3*

（1.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南長沙410208；2.湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙410208；3.湖南中醫藥大學中醫方證研究轉化醫學湖南省高校重點實驗室，湖南長沙410208）

·基礎研究·

二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的建立

谷捷1，李鑫1，余黃合1，2，王寶新1，黃惠勇1，曾嶸2*，蔡雄1，3*

（1.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南長沙410208；2.湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙410208；3.湖南中醫藥大學中醫方證研究轉化醫學湖南省高校重點實驗室，湖南長沙410208）

目的通過對二甲苯的用量和保留時間進行研究，優選二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的最佳成模條件。方法二甲苯涂抹昆明系小鼠右耳廓上下兩面，誘導建立急性耳腫脹，對二甲苯劑量（20、30、40μL）和保留時間（30、45、60、75、90 min）進行優選，并采用陽性藥對優選建立的小鼠耳腫脹急性炎癥模型進行驗證。結果二甲苯用量對鼠耳腫脹率影響不明顯（P＞0.05）；但隨保留時間延長，耳腫脹度呈下降趨勢，且90 min組與30 min組比較有顯著性差異（P=0.045）。與模型組比較，經吲哚美辛治療后，耳腫脹度顯著降低（P=0.007），TNF-α含量亦明顯下降（P＜0.001）。結論二甲苯用量20μL，保留時間30 min，可成功建立最佳的小鼠耳腫脹急性炎癥模型。

二甲苯；耳腫脹急性炎癥；致炎劑用量；保留時間

〔Abstract〕Objective To investigate the optimal dosage and retention time of dimethylbenzene for the induction of a mouse ear edema.M ethods Dimethylbenzene was applied evenly on the surface of both sides of the auricle of mice to induce acute inflammation.Different dosages（20，30，40μL）and retention time（30，45，60，75，90 min）of dimethylbenzene were compared to optimize these main variables for the induction of ear edema in mice.For verifing the model parameters a positive drug was performed.Results Increase in the dosage of dimethylbenzene resulted in no significant increase in the ear edema（P＞0.05）；while the ear edema rate was decreased with the retention time prolonged，and marked reduction in the rate of ear edema was attained between 30 and 90 min.Compared with the vehicle-control mice，the ear edema rate（P=0.007）and serum values of TNF-α（P＜0.001）decreased significantly in mice treated with indomethacin.Conclusion The optimal mouse model of ear edema is induced by applying 20μL dimethylbenzene with 30 min retention.

〔Keywords〕dimethylbenzene；acute inflammation of ear edema；dosage；retention time.

炎癥是機體對各種致炎因子引起損傷所產生的以防御反應為主的病理過程［1］，局部表現為紅、腫、熱、痛和功能障礙等。炎癥見于多種疾病的病理過程，前期多以急性炎癥為主，遷延不愈則轉為慢性炎癥，嚴重影響疾病預后和患者生活質量［2］。因此，開發安全有效的抗炎藥物臨床價值巨大，而藥物的研發多以選擇病變程度適中、容易復制、重現性好、經濟的疾病動物模型，全面、客觀地評價藥效作用為前提。

二甲苯是常用的化學致炎劑，可誘導組胺、激肽及纖維蛋白溶解酶等炎癥介質釋放，進而引起局部毛細血管通透性的增加、炎癥細胞的浸潤、急性滲出性炎性水腫等［3］。中藥創新藥物研發中，常以二甲苯誘發小鼠耳殼急性腫脹，模擬機體急性炎癥的病理狀態，以評價藥物抗炎作用，然而由于二甲苯涂抹劑量和保留時間缺乏統一的標準［4-7］，導致模型誘導的成功率低，且穩定性差，從而限制了模型在抗炎中藥新藥研究中的應用。基于此，本研究對二甲苯涂抹劑量和保留時間等模型誘導的關鍵參數進行了比較研究，以期建立成功率高、穩定性強、易于復制的小鼠耳腫脹急性炎癥模型，為中藥新藥研究的抗炎作用評價提供科學、可靠的實驗動物模型。

1　材料與方法

1.1實驗動物

昆明系小鼠，SPF級，體質量（20±2）g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：43004700007921。

1.2試劑及儀器

二甲苯（批號：20140108，天津恒興試劑有限公司）；吲哚美辛（批號：A14070，山西云鵬制藥有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）單抗由長沙維爾生物科技科技有限公司提供；打孔器、移液槍、灌胃器。

1.3二甲苯涂耳劑量的優選

取昆明小鼠30只，分層隨機化分為3組，每組10只，分別精密吸取均勻二甲苯涂布于各鼠右耳上、下兩面，劑量分別為20、30、40μL，左耳不涂作對照。于涂耳30 min后，處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，采用6 mm直徑打孔器于左右耳對稱部位打下耳片，用精密電子天平稱取各鼠耳質量，并計算鼠耳腫脹率［腫脹率=（右耳質量-左耳質量）/左耳質量×100%］。

1.4涂耳保留時間的優選

取昆明小鼠50只，分層隨機化分為5組，每組10只，分別吸取“1.3”實驗確定的最佳劑量二甲苯均勻涂布于各鼠右耳上、下兩面，左耳不涂作對照。分別于涂布后30、45、60、75、90 min，處死小鼠，余下操作同“1.3”處理。

1.5模型驗證

取昆明小鼠60只，分層隨機化分為空白組、模型組、陽性藥物（吲哚美辛）組3組，每組20只。吲哚美辛組給予吲哚美辛藥液一次性灌胃，給藥劑量（10 mg/kg），空白組、模型組給等容積蒸餾水。給藥1 h后，吸取20 uL的二甲苯均勻涂布于各鼠右耳上、下兩面，左耳不涂作對照。涂布30 min后，每組取10小鼠處死，余下操作同“1.3”處理。每組另10只行摘眼球取血，將血放入4℃，3 500 r/min環境離心，15 min后取血清檢測TNF-α。

1.6統計分析

2　實驗結果

2.1二甲苯涂耳劑量的優選結果

小鼠耳腫脹率隨著二甲苯用量的增加（20、30、40μL）呈上升趨勢，但三組數據差異無統計學意義（P＞0.05）。綜合考慮小鼠耳廓的覆蓋能力及二甲苯的毒性，我們確定最佳涂耳劑量為20μL。見圖1。

圖1　二甲苯涂耳劑量的優選（±s，n=10）

2.2二甲苯涂耳保留時間的優選結果

隨著涂耳保留時間的推移，各組鼠耳的腫脹率呈下降趨勢，其中30 min組的腫脹率與90 min組比較差異有顯著性（P=0.045）。因此，選擇最佳時間為30 min。見圖2。

圖2　二甲苯涂耳保留時間的優選（±s，n=10）。

2.3二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型條件的驗證

實驗結果顯示，與模型組相比，吲哚美辛組小鼠耳腫脹率顯著降低（P=0.007），血清中TNF-α含量亦明顯減少（P＜0.001）。見圖3-5。

圖3　二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的評價（±s，n=10）

圖4　不同組中血清TNF-α濃度（±s，n=10）

圖5　模型組和吲哚美辛組自身左右耳對比圖

3　討論

炎癥動物模型的成功構建是影響中藥抗炎創新藥物研究的重要因素之一。急性炎癥模型常以二甲苯、TPA、花生四烯酸等物質作為致炎劑［8-13］，而二甲苯由于致炎機制與臨床常見急性炎癥相似、操作簡單、不需要特殊設備、見效快、復制成功率高且實驗動物價格低廉等優點，廣泛用于中藥抗炎創新藥物的抗炎效應評價和抗炎活性目標化合物的篩選等［13-15］，也常被藥理學等課程實驗教學所選用。然而，查閱相關研究文獻，研究團隊發現決定二甲苯致小鼠耳急性腫脹模型成功構建的關鍵因素——二甲苯涂抹劑量和保留時間缺乏統一的標準［4-7］，涂抹劑量和保留時間的不規范，不但影響了該模型的成功構建，而且影響了中藥創新藥物研發。

研究團隊在實驗操作過程中，發現二甲苯涂抹用量為20μL時即可完全覆蓋鼠耳上、下兩面，而超過20μL，由于“虹吸效應”二甲苯滲透到小鼠背部及眼周，引起小鼠的極度不適，進而影響實驗成功。且二甲苯涂抹用量在20～40μL時，鼠耳腫脹率隨著涂抹劑量增加成上升趨勢，但無統計學差異（P＞0.05）。綜合上述因素，研究團隊認為，二甲苯涂抹劑量以20μL為宜。二甲苯引起的耳腫脹急性炎癥模型可能主要引起組胺、緩激肽等炎癥介質的釋放，引起局部血管擴張、毛細血管通透性增加、炎癥細胞浸潤，造成耳部急性滲出性炎癥水腫，具有自愈性、自橫性的特點［16-18］，因此二甲苯涂耳保留時間亦需要進行考察。結果表明，隨著二甲苯保留時間的延長，鼠耳腫脹呈下降趨勢。因此，研究團隊認為保留時間30 min為佳。

吲哚美辛是一種常用有效的非甾體抗炎藥，TNF-α作為一種促炎癥因子和免疫調節因子，在炎癥的初始階段中起核心作用，是啟動炎癥的重要細胞因子［19-22］。基于所篩選的二甲苯涂抹劑量20μL、保留時間30 min，采用吲哚美辛進行模型評價，選擇TNF-α作為炎癥反應的指標。研究顯示，吲哚美辛組鼠耳腫脹率明顯低于模型組（P=0.007），TNF-α含量亦顯著降低（P＜0.001）。提示，經過優化篩選的實驗參數二甲苯為致炎劑，精密吸取20μL，均勻涂布于各鼠右耳上、下兩面，保留時間為30 min可以成功構建小鼠耳腫脹急性炎癥模型。

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（本文編輯 匡靜之）

Establishment of Acute Inflammation M ice M odels w ith Ear Edema Induced by Dimethylbenzene

GU Jie1，LI Xin1，YU Huanghe1，2，WANG Baoxin1，HUANG HuiYong1，ZENG Rong2*，CAI Xiong1，3*
（1.Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostics in Chinese Medicine，2.School of Pharmacy，3.Hunan Department of Education's Key Laboratory of Translational Chinese Medicine，Hunan University Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

R285.5；R76

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.05.008

2015-07-03

國家自然科學基金項目（81373540）；湖南省中醫藥科研計劃項目（201308）；湖南省教育廳科學研究重點項目（12A107）；湖南中醫藥大學中醫診斷國家重點學科開放基金重點項目（2014-8）；湖南省大學生創新性實驗計劃項目（2014202）。

谷捷，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥抗炎免疫藥理研究。

*蔡雄，男，教授，博士研究生導師，E-mail：caix12@qq.com；曾嶸，女，教授，碩士研究生導師，E-mail：472719275@qq.com。