EZH2抑制劑DZNeP對人乳腺癌細胞增殖、凋亡及相關信號通路的影響

迪力夏提·金斯汗　吐魯洪·沙列爾　趙　倩

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科,新疆　烏魯木齊　830011)

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EZH2抑制劑DZNeP對人乳腺癌細胞增殖、凋亡及相關信號通路的影響

迪力夏提·金斯汗吐魯洪·沙列爾趙倩

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科,新疆烏魯木齊830011)

目的探討EZH2抑制劑DZNeP對人乳腺癌細胞增殖、凋亡及相關信號通路的影響。方法取對數生長期乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231，經2.5、5、10、20 μmol/L DZNeP處理后(設不加DZNeP僅添加完全培養基組為對照組)，采用四甲基偶氮唑鹽比色法檢測各組24、48、72 h的增殖抑制率，Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測各組24、48 h的凋亡率，收集20 μmol/L DZNeP處理72 h的MCF-7、MDA-MB-231細胞，采用Western印跡檢測磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路和Wnt/β-連接素(β-catenin)通路中的蛋白變化。結果DZNeP在2.5～20 μmol/L范圍內可抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖，且與對照組相比增殖抑制率升高(P<0.05)，該抑制效應呈濃度和時間依賴性；與對照組相比，DZNeP處理組的凋亡率均升高(P<0.05)，DZNeP各濃度處理48 h的凋亡率均高于24 h(P<0.05)；PI3K/Akt通路中，與對照組相比，20 μmol/L DZNeP處理72 h后MCF-7、MDA-MB-231細胞的PTEN水平均升高，Akt水平均降低(P<0.05)；而在Wnt/β-catenin通路上，20 μmol/L DZNeP處理72 h后兩細胞株中的β-catenin、Cyclin D1和C-myc水平均降低(P<0.05)。結論DZNeP可抑制人乳腺癌細胞增殖并誘導其凋亡，可能與抑制腫瘤惡性行為相關的PI3K/Akt、Wnt/β-catenin通路有關，在乳腺癌治療上有一定應用前景。

EZH2抑制劑；乳腺癌；增殖；凋亡；信號通路

乳腺癌已成為影響女性生命健康的惡性腫瘤之一，目前發病率逐年上升，嚴重影響女性身心健康〔1〕。目前研究認為，表觀遺傳調控紊亂是包括乳腺癌在內惡性腫瘤的重要特征，組蛋白是重要的表觀遺傳調控位點〔2〕。組蛋白上的多個氨基酸可被共價鍵修飾，如甲基化、乙酰化和泛素化等，其中乙酰化與甲基化相互關聯〔3〕。EZH2為一種調節組蛋白修飾的酶，具有甲基轉移酶和組蛋白去乙酰化酶的調控作用，可通過參與靶基因的轉錄抑制來促進細胞增殖，在腫瘤的發生發展中起重要作用〔4,5〕。在乳腺癌中針對EZH2靶向治療的研究尚屬空白，本研究選取EZH2抑制劑DZNeP處理乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞，觀察其對細胞增殖、凋亡及相關信號通路的影響。

1　材料與方法

1.1細胞株與試劑乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231購自中國科學院上海生命科學院細胞庫，DZNeP購自美國Selleck公司，Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司，噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)及雙抗(青霉素、鏈霉素)購自美國 Amresco公司，胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶及RPMI 1640培養基均購自美國Gibco公司，兔抗人β-catenin多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗人Akt、C-myc多克隆抗體均購自Transduction Laboratories公司，兔抗人PTEN、Cyclin D1及內參GAPDH多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2細胞培養將MCF-7、MDA-MB-231復蘇后，采用含10% FCS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基于溫度為37℃，CO2體積分數為5%的培養箱內培養，48 h后首次換液，其后每2～3 d換液1次，待細胞達80%～90%融合經胰酶消化后，傳代培養。

1.3細胞增殖檢測取對數生長期MCF-7、MDA-MB-231細胞，采用胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，調節濃度至1×105/ml，接種于96孔培養板，向每孔加入20 μl DZNeP溶液，使終濃度依次為2.5、5、10、20 μmol/L(以不加藥物的作對照)，每個濃度設3個平行孔，常規培養24、48、72 h后，向每孔加入10 μl MTT工作液，繼續培養4 h后，加入DMSO溶液終止培養，采用酶標儀檢測492 nm下的吸光值(A)，根據公式計算DZNeP處理組相對于對照組的增殖抑制率：抑制率(%)=(A對照組-ADZNeP處理組)/A對照組×100%。

1.4細胞凋亡率檢測收集不同濃度DZNeP處理24、48 h的MCF-7、MDA-MB-231細胞1×106個，經PBS緩沖液沖洗后，加入200 μl凋亡結合液后輕輕吹散細胞，加入5 μl Annexin-FITC和10 μl PI，避光反應15 min后，采用FACS Calibur 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5Western印跡收集20 μmol/L DZNeP處理72 h后的MCF-7、MDA-MB-231細胞，冰上裂解后室溫放置10 min，12 000 r/m離心10 min，采用BCA法檢測上清液的蛋白含量，每孔取20 μg蛋白樣品至10% SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后采用半干轉法將蛋白轉移至22 μm孔徑硝酸纖維素膜，加適量的Akt、PTEN、β-catenin、C-myc和Cyclin D1一抗(除β-catenin的稀釋度為1∶200外，其余均為1∶300)，4℃孵育過夜后加入二抗，SuperECL Plus超敏發光液進行化學發光顯色，將顯影后的X線片用Gel-Pro Analyzer 3.1分析光密度，蛋白的相對表達量為與內參GAPDH的比值。

1.6統計學處理采用SPSS18.0軟件，多組比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)，兩兩比較采用SNK法。

2　結　果

2.1DZNeP對MCF-7細胞增殖的影響DZNeP在2.5～20 μmol/L范圍內可抑制MCF-7細胞增殖，且與對照組相比，DZNeP處理組的增殖抑制率均升高(P<0.05)；高濃度DZNeP(20 μmol/L)處理72 h后的增殖抑制率達70%以上。見表1。

2.2DZNeP對MDA-MB-231細胞增殖的影響DZNeP在2.5～20 μmol/L范圍內可抑制MDA-MB-231細胞增殖，且與對照組相比，DZNeP處理組的增殖抑制率均升高(P<0.05)；高濃度DZNeP(20 μmol/L)處理72 h后的細胞基本死亡。見表2。

2.3DZNeP對MCF-7細胞、MDA-MB-231細胞凋亡的影響DZNeP在2.5～20 μmol/L范圍內可誘導MCF-7、MDA-MB-231細胞凋亡，且與對照組相比，DZNeP處理組的凋亡率均升高(P<0.05)；DZNeP各濃度處理48 h的凋亡率均高于24 h(P<0.05)。見表3，表4。

表1　不同濃度DZNeP作用于MCF-7細胞的增殖抑制率±s,%)

與0 μmol/L組比較:1)P<0.05；與2.5 μmol/L組比較:2)P<0.05；與5 μmol/L組比較:3)P<0.05；與10 μmol/L組比較:4)P<0.05；表2～表4同

表2　不同濃度DZNeP作用于MDA-MB-231細胞的增殖抑制率±s,%)

表3　DZNeP對MCF-7細胞凋亡的影響

表4　DZNeP對MDA-MB-231細胞凋亡的影響(%)

2.4DZNeP對乳腺癌細胞相關信號通路的影響

2.4.1PI3K/Akt通路與對照組相比，20 μmol/L DZNeP處理72 h后MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的PTEN水平均升高，Akt水平均降低(P<0.05)。見圖1、表5。

2.4.2Wnt/β-catenin通路與對照組相比，20 μmol/L DZNeP處理72 h后MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的β-catenin、Cyclin D1和C-myc水平均降低(P<0.05)。見圖1、表5。

表5　DZNeP對乳腺癌細胞相關通路的影響±s)

與對照組比較：1)P<0.05

圖1　DZNeP對乳腺癌細胞相關信號通路蛋白表達的影響

3　討　論

研究發現，EZH2在多種腫瘤組織中異常高表達〔6,7〕，其可通過轉錄后修飾來沉默抑癌基因的表達，其中包括促凋亡基因及抑制癌細胞惡性轉化的基因，繼而促進腫瘤組織的生長和浸潤〔8〕。EZH2在消化道腫瘤中表達的研究較為廣泛，如鄧飛等〔6〕的研究指出EZH2高表達與結腸癌患者的淋巴結轉移及Duke分期有關，高德全等〔7〕發現EZH2與胃癌的浸潤深度、TNM分期、分化程度及淋巴結轉移均有關。此外，EZH2還參與了癌細胞的上皮間質轉化和干細胞干性調節〔9〕。然而，EZH2與乳腺癌細胞增殖、凋亡的關系目前尚不明確。

DZNeP為S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑，在多種惡性腫瘤細胞均發現，其可通過抑制EZH2表達來發揮抗腫瘤作用，有望成為靶向治療的候選藥物〔8〕。異常增殖是惡性腫瘤的基本特征，DZNeP已被證實可抑制食管鱗狀細胞癌 Eca109細胞、頭頸部鱗癌Tb3.1細胞及結腸癌HCT116細胞的增殖〔9～11〕。本研究采用MTT法檢測發現，DZNeP處理后兩種乳腺癌細胞的增殖能力均受抑制，且增殖抑制率受作用時間和濃度的影響，表明DZNeP可抑制乳腺癌細胞的增殖過程。此外，誘導細胞凋亡是DZNeP抑制腫瘤惡性轉化的基本方式之一，本研究也證實DZNeP可誘導兩種乳腺癌細胞的凋亡，與相關的報道一致〔9～11〕。以上指出DZNeP在乳腺癌的治療上有較好的前景，但仍需臨床前期研究的結果支持。

EZH2表達可影響抑癌基因的表達，導致與癌細胞惡性高度相關的信號通路激活，如PI3K/Akt通路和Wnt/β-catenin通路〔12,13〕。本研究結果顯示，DZEeP對PI3K/Akt通路起負性調節作用的抑癌基因PTEN水平升高，而處于PI3K/Akt通路中心環節的Akt水平降低，提示DZNeP可抑制乳腺癌細胞中PI3K/Akt通路的活化。同時，Wnt/β- catenin通路的關鍵分子β-catenin、C-myc和Cyclin D1水平均降低，提示DZNeP對Wnt/β-catenin通路活化也有較好抑制效果。鑒于DZNeP處理后抑癌基因PTEN的水平升高，而癌基因C-myc水平降低，進一步提示EZH2可通過抑制抑癌基因的表達來促進癌細胞的增殖，EZH2有望成為癌癥靶向治療的新靶點。

1Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016〔J〕.CA Cancer J Clin,2016;66(1):7-30.

2劉曦宇,裴長艷,崔有斌,等.基因芯片檢測甲基化在中老年食管鱗狀細胞癌(ESCC)中的應用前景〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(15):4408-12.

3Liu TP,Hong YH,Tung KY,etal.In silico and experimental analyses predict the therapeutic value of an EZH2 inhibitor GSK343 against hepatocellular carcinoma through the induction of metallothionein genes〔J〕.Oncoscience,2016;3(1):9-20.

4Liu S,Chen D,Shen W,etal.EZH2 mediates the regulation of S100A4 on E-cadherin expression and the proliferation,migration of gastric cancer cells〔J〕.Hepatogastroenterology,2015;62(139):737-41.

5Sun S,Yu F,Zhang L,etal.EZH2,an on-off valve in signal network of tumor cells〔J〕.Cell Signal,2016;28(5):481-7.

6鄧飛,李擁軍,蔡正斌,等.結腸癌組織中EZH2和PTEN基因表達與臨床病理特征的相關性分析〔J〕.現代腫瘤醫學,2015;23(17):2466-9.

7高德全,趙彥婷,劉云云,等.EZH2在胃癌組織血管生成中的作用及意義〔J〕.河北醫藥,2013;35(22):3391-2.

8Wei FZ,Cao Z,Wang X,etal.Epigenetic regulation of autophagy by the methyltransferase EZH2 through an MTOR-dependent pathway〔J〕.Autophagy,2015;11(12):2309-22.

9王晶,劉新秀,劉濤,等.EZH2基因在結直腸癌腫瘤干細胞化療中的臨床意義及耐藥作用〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(22):6436-8.

10王瑞莉,李慶華,張彥婷,等.DZNep對 Eca109細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響〔J〕.鄭州大學學報(醫學版),2014;49(4):449-52.

11孔令平,周旋,孫姍姍,等.EZH2抑制劑DZNEP影響人頭頸部鱗癌增殖與凋亡的體內外研究〔J〕.天津醫科大學學報,2015;21(6):461-5.

12Riquelme E,Behrens C,Lin HY,etal.Modulation of EZH2 expression by MEK-ERK or PI3K-AKT signaling in lung cancer is dictated by different KRAS oncogene mutations〔J〕.Cancer Res,2016;76(3):675-85.

13Jung HY,Jun S,Lee M,etal.PAF and EZH2 induce Wnt/β-catenin signaling hyperactivation〔J〕.Mol Cell,2013;52(2):193-205.

〔2015-11-17修回〕

(編輯徐杰)

吐魯洪·沙列爾(1963-)，男，主任醫師，碩士生導師，主要從事乳腺疾病研究。

迪力夏提·金斯汗(1982-)，男，主治醫師，碩士，主要從事乳腺疾病研究。

R739

A

1005-9202(2016)16-3877-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.004