表皮角質細胞與血管內皮細胞共培養對血管內皮生長因子水平的影響

張　燕　王　濤　劉桂麗　李瑞靜　高順強　王文氫　程　毅

(河北醫科大學第四醫院皮膚科，河北　石家莊　050011)

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表皮角質細胞與血管內皮細胞共培養對血管內皮生長因子水平的影響

張燕王濤1劉桂麗李瑞靜高順強王文氫程毅

(河北醫科大學第四醫院皮膚科，河北石家莊050011)

目的探討人表皮角質細胞與血管內皮細胞共同培養對血管內皮生長因子(VEGF)作用的機制。方法購制人表皮角質細胞和血管內皮細胞進行體外培養，采用雙腔通透性測定試劑盒建立細胞共培養模型，應用濃度為15 ng/ml的重組人血管內皮生長因子(VEGF)121和VEGF165作為對照組。利用熒光酶標儀測定不同時間段FITC-dextran量變化，觀察血管內皮細胞單層通透性的改變。采用Griess法測定血管內皮細胞產生氧化氮(NO)的變化。結果共培養模型中，血管內皮細胞、表皮角質細胞生長良好，以連續單層形式存在；內池中VEGF121水平在5、30 min、1、2、3、4、5、6 h顯著高于VEGF165 (P<0.05)；在0、1、5、10 min，共培養模型內池中NO的含量低于VEGF121刺激組(P<0.05)，但高于VEGF165刺激組(P<0.05)。結論(1)表皮角質細胞分泌VEGF有時間依賴性，其中VEGF121含量較VEGF偏多。(2)表皮角質細胞分泌物可誘導NO產生，其能力介于VEGF121和VEGF165，因此考慮表皮角質細胞分泌物中引起NO產生增加的主要成分為VEGF。(3)表皮角質細胞分泌物可引起血管內皮通透性增加，其能力介于VEGF121和VEGF165，且數值接近于VEGF121，因此考慮表皮角質細胞分泌物中VEGF121較VEGF165含量高，且VEGF121較VEGF165引起血管通透性能力強。

表皮角質細胞；血管內皮細胞；血管內皮生長因子

目前人類已經發現的皮膚病約有2 000余種，且多數發病機制尚不完全明了，也無理想的治療方法〔1〕。特應性皮炎患者在急性期以紅斑、滲出為主要表現，其病理表現是真皮乳頭層毛細血管網擴張而產生的紅色斑疹，進而持續擴張導致血管通透性增高而出現真皮浮腫，其原因考慮是該類患者表皮中血管內皮生長因子(VEGF)121較VEGF165含量明顯增高所造成的〔2〕。但其具體發病機制需要進一步的研究去闡明。

VEGF在表皮主要由角質形成細胞(KC)分泌，目前研究最多的亞型包括VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189等。特異性皮炎時，皮膚KC能夠分泌更多的VEGF，從而促進真皮層微血管增生〔3〕。本文擬研究人表皮細胞產生的VEGF對血管內皮細胞的作用機制，進而探討特應性皮炎的可能發病機制。

1　對象與方法

1.1主要儀器和試劑人臍靜脈內皮細胞、人表皮角質細胞，美國Invitrogen公司；角化細胞生長培養基(KGM-2)、內皮細胞生長培養基(EGM-2)，美國Lonza公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料公司；重組人VEGF121和 VEGF165抗體，美國Minneapolis公司；十二水磷酸氫二鈉，天津市化學試劑廠；CO2恒溫培養箱，美國Sheldon公司；倒置顯微鏡，日本Nikon公司；多功能酶標儀(SynergyⅡ)，美國biotek公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養分別將1 ml凍存的人臍靜脈內皮細胞、人表皮角質細胞直接浸泡在37℃溫水中輕輕搖動，讓細胞充分融化。從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，采用吸管將細胞懸液吸出，向離心管中加入10倍以上的培養液，充分混合均勻，1 000 r/min離心5 min。去除上清液，分別加入EGM-2 及KGM培養基，重懸細胞，調整細胞密度，并將其分別接種在培養瓶中，放入37℃、5%CO2培養箱中進行培養，隔日換液一次，待細胞融合85%后進行傳代培養。傳代細胞的密度控制在不低于5×105/ml，以免影響傳代細胞的生長。待細胞再次融合為85%后凍存備用。

1.2.2共培養模型的建立應用雙腔通透性測定試劑盒，檢測單層血管內皮細胞在表皮角質細胞分泌的物質作用下通透性的變化。雙腔通透性測定試劑盒主要由內池和外池構成，內池底部為多聚碳酸脂膜的培養碟，直徑0.8 μm，外池為普通培養碟。向內池加入200 μl膠原蛋白，孵育1 h，保證溶液能完全覆蓋底部且沒有氣泡，去除膠原蛋白，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1次，將培養的人臍靜脈內皮細胞加入EGM-2完全培養液。向外池內加入人表皮角質細胞，并加入KGM-2完全培養液。將以上兩種細胞放入37℃、5%CO2培養箱中分別培養，觀察兩種細胞生長情況。當血管內皮細胞形成完整的單層結構，將內外池組合，構建人臍靜脈內皮細胞、表皮角質細胞共培養的體外模型。

1.2.3實驗組與對照組設計將共培養模型內池更換為EGM-2去生長因子培養液，外池更換為去生長因子KGM-2培養液。采用人重組VEGF121和VEGF165作為對照，濃度15 ng/ml。與實驗組不同之處為外池無培養側表皮膠質細胞，內池的實驗溶液中分別加入VEGF121和VEGF165。將以上實驗組及對照組組合完成后放置在37℃、5%CO2培養箱中培養，備用。

1.2.4一氧化氮(NO)測定根據NO穩定的最終代謝產物亞硝酸鹽在酸性環境中與 Griess 試劑中的氨基苯碘酸等物質進行反應，產生鮮橙紅色產物，在545 nm下確定最大光吸收，顏色越深，表示NO含量越高。分別于0、1、5、10 min對內池中NO含量進行測定。

1.2.5觀察指標(1)人血管內皮細胞及表皮角質細胞在共培養模型中的形態；(2)共培養模型內池中VEGF121和VEGF165在5、30 min、1、2、3、4、5、6 h的水平；(3)5、30 min、1、2、3、4、5、6 h共培養模型中血管內皮細胞單層通透性的變化；(4)共培養模型內池中NO在0、1、5、10 min的水平。

1.3統計學方法應用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2　結　果

2.1共培養模型中血管內皮細胞及表皮角質細胞生長狀態兩種細胞生長良好。形態觀察：獲得的內皮細胞、表皮角質細胞以連續單層形式存在于血管內腔表面，形態扁平、略長、多角形為主，細胞排列比較緊密。見圖1。

2.2血管內皮細胞、表皮角質細胞VEGF121和VEGF165水平比較各時間段血管內皮細胞以及表皮角質細胞中VEGF121水平均顯著高于VEGF165(P<0.05)。見表1。

2.3共培養模型內池中NO含量的檢測在0、1、5、10 min，共培養模型內池中NO的含量低于VEGF121刺激組(P<0.05)，但高于VEGF165刺激組(P<0.05)。見表2。

2.4表皮角質細胞分泌物對血管內皮通透性的影響表皮角質細胞分泌物可引起血管內皮通透性增加，其能力介于VEGF121和VEGF165，且數值接近于VEGF121，因此考慮表皮角質細胞分泌物中VEGF121較VEGF165含量高，且VEGF121較VEGF165引起血管通透性能力強(P<0.05)。見表3。

圖1　血管內皮細胞、表皮角質細胞形態觀察(×200)

指標5min30min1h2h3h4h5h6hVEGF1210.785±0.0245.217±0.47311.931±0.22623.987±0.07433.787±0.77146.346±0.65056.244±0.23271.207±0.496VEGF1650.625±0.0283.603±0.1047.503±0.12315.138±0.19620.843±0.35127.234±0.29929.932±0.93046.742±0.613t/P值19.53/<0.0520.44/<0.0517.42/<0.0522.04/<0.0519.53/<0.0520.44/<0.0517.42/<0.0522.04/<0.05

表2　共培養模型內池中NO含量的檢測±s)

與共培養組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;下表同

表3　表皮角質細胞分泌物對血管內皮通透性的影響±s)

3　討　論

皮膚病是一種常見的容易復發的慢性炎癥性疾病，患者發病后臨床癥狀顯著，如果不采取積極有效的治療方法，將會對患者身體健康產生較大影響〔4〕。微血管是皮膚組織與循環血液進行交換的場所，組織增生超過正常血管供應范圍時將會引起組織缺氧、抑制組織增生。文獻報道顯示〔5〕：血管生成屬于一種比較復雜的過程，涵蓋了血管內皮細胞的激活、降解、增殖等。因此，研究表皮角質細胞與血管內皮細胞培養VEGF具有重要的意義。

VEGF具有良好的生物學特性，能增加血管通透性，對血管內皮細胞具有特異性〔6〕。相關研究顯示〔7〕：正常人皮膚中含有較高的VEGF，能維持機體微血管密度，從而能夠保持血管的通透性。VEGF的調節相對復雜，缺氧能強烈誘導VEGF的表達。缺氧首先誘導VEGF mRNA轉錄，再由VEGF啟動子位點的轉錄子缺氧誘導因子介導VEGF表達。

表皮角質細胞與血管內皮細胞均屬于一類特殊的細胞，具備良好的生物特性，能夠在特定的環境下參與血液、組織之間的營養交換。同時，表皮角質細胞與血管內皮細胞能在血管的形成、血管動力學等方面發揮作用。通常情況下，表皮角質細胞與血管內皮細胞以單層、連續方式存在，形態以扁平、略長、多角形為主，細胞排列比較緊密。同時，表皮角質細胞與血管內皮細胞之間具有一定的黏附性，能緊密連接和縫隙連接。血管內皮細胞是血管、血管壁的屏障，由于內皮細胞具有良好的通透性，能直接參與細胞的血液傳遞、運動調節，參與機體炎癥反應，影響血管的發生、血管通透性和液體的平衡等〔8〕。

在皮膚病患者中，皮損區VEGF水平高于非皮損區及正常皮膚，并且患者病情越嚴重，VEGF水平越高。VEGF在特應性皮炎患者體內生物學特點相對活躍：(1)VEGF能夠提高血管細胞的通透性；(2)VEGF能與表皮角質細胞、血管內皮細胞結合，促進細胞發生裂解，促進血管生成。本研究中，在不同時間段，血管內皮細胞、表皮角質細胞VEGF121和VEGF165水平均呈現上升趨勢，但是VEGF121水平上升幅度顯著高于VEGF165。

NO功能相對較多，如神經傳導功能、抑制血小板聚集、松弛血管平滑肌以及細胞毒性及免疫功能，增加血管通透性，提高血管舒張壓，為機體提供血量。VEGFR-2能夠介導生成NO和前列腺素，使血管平滑肌得到松弛。

綜上，表皮角質細胞與血管內皮細胞共同培養后VEGF121和 VEGF165水平均明顯升高，可以引起血管內皮細胞通透性增加，進一步刺激產生NO。但是，VEGF121對通透性的影響明顯高于 VEGF165，具有較高的臨床應用價值。

1蔣建華，多蘭.新疆地區維吾爾族尋常型銀屑病與HLA-DRB1 07等位基因的關聯研究〔J〕.醫學研究生學報，2012；25(1)：54-7.

2Miyoshi K,Takaishi M,Nakajima K，etal.Stat3 as a therapeutic target for the treatment of psoriasis：a clinical feasibility study with STA-21，a Stat3 inhibitor〔J〕.Invest Dermatol，2011；131(1)：108-17.

3Nast A，Boehncke WH，Mrowietz U，etal.S3-Guidelines on the treatment of psoriasis vulgaris (English version).Update〔J〕.J Dtsch Dermatol Ges，2012；10(2)：S1-95.

4楊斌，鄧立歡，李秉航，等.角質細胞生長因子及氯化鋰誘導毛囊干細胞定向分化中的信號通路〔J〕.中國組織工程研究，2014；18(19)：3060-8.

5Johnston A，Xing X，Guzman AM，etal.IL-1F5，-F6，-F8，and-F9：a novel IL-1 family signaling system that is active in psoriasis and promotes keratinocyte antimicrobial peptide expression〔J〕.J Immunol，2011；186( 4)：2613-22.

6劉瑞風，尹國華，張靜，等.尋常型銀屑病患者骨髓間充質干細胞生物學特性研究〔J〕.中華微生物學和免疫學雜志，2010；30(3)：238.

7龍庭鳳，何黎，劉流，等.人日光性角化病角質形成細胞的體外培養〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2010；14(20)：3660-5.

8Guo A，Jahoda CA.An improved method of human keratinocyte culture from skin explants：cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells〔J〕.Exp Dermatol，2009；18(8)：720-6.

〔2016-03-28修回〕

(編輯袁左鳴)

國家自然科學基金青年基金項目(81101179)

張燕(1975-)，女，副教授，副主任醫師，主要從事皮膚科基礎研究。

R392.12

A

1005-9202(2016)16-3885-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.007

1河北省人民醫院腎內科