吡格列酮對戊四氮致癇大鼠Toll樣受體、核因子-κB表達的影響

金玉玲　單　鶴　劉　蕾

(佳木斯大學附屬第一醫院神經一科，黑龍江　佳木斯　154003)

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吡格列酮對戊四氮致癇大鼠Toll樣受體、核因子-κB表達的影響

金玉玲單鶴劉蕾

(佳木斯大學附屬第一醫院神經一科，黑龍江佳木斯154003)

目的研究過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)γ激動劑吡格列酮對癲癇大鼠海馬組織Toll樣受體(TLR)4及核因子(NF)-κB表達的影響。方法建立雄性SD大鼠腹腔注射PTZ誘導癲癇模型，根據組別給予不同劑量PTZ連續灌胃，RT-PCR法檢測各組大鼠海馬區TLR4及NF-κB含量，免疫熒光檢測TLR4及NF-κB蛋白表達。結果通過RT-PCR及免疫組化檢測，癲癇模型組(PTZ)大鼠腦海馬TLR4、NF-κB含量比正常對照組(NC組)增高(P<0.05)；PTZ干預低、中、高劑量組(PL、PM、PH組)的TLR4、NF-κB表達量較PTZ組減低(P<0.05)，且隨著PTZ干預劑量增加而調低，并于PH組顯著下降(P<0.05)。結論戊四氮致癇大鼠海馬區TLR4及其下游信號NF-κB表達增加，PPARγ激動劑吡格列酮能夠通過降低TLR4及NF-κB表達，從而減輕癲癇發作對神經系統的炎性損傷，這可能是其對神經細胞保護作用的潛在機制之一。

癲癇；戊四氮；過氧化物酶增殖物激活受體γ；吡格列酮；Toll樣受體4；核因子-κB

癲癇發病機制及其治療方法是目前研究的熱點。癲癇發作后明顯存在炎癥反應，而炎癥反應增加了神經元的興奮性、加速了癲癇發作后神經元的凋亡，進一步影響了癲癇的再次發作，增加了癲癇發作的易感性。調節炎癥反應信號的激活可阻斷這些細胞因子的產生而達到治療目的。癲癇是以腦部神經元過度發放所致突發、反復、短暫的中樞神經系統功能失常為特征。過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)γ的激活與神經細胞的炎癥和氧化應激有關，目前對其研究主要集中在急性腦缺血再灌注早期對神經系統的作用，本實驗研究PPARγ受體激動劑吡格列酮預處理對戊四氮致癇大鼠腦組織Toll樣受體(TLR)4及核因子(NF)-κB表達的影響。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑SD健康大鼠(由大連醫科大學動物實驗中心提供)；戊四氮(美國SIGMA公司)；吡格列酮(PTZ，沈陽施德藥業有限公司)；TRIzol總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen)；cDNA合成試劑盒(Fermentas)；PCR儀、微量加樣槍(Eppendorf)；凝膠成像系統(OMEGA)；兔抗TLR4多克隆抗體、兔抗NF-κB多克隆抗體(BOSTER)。

1.2實驗動物分組與模型建立SD雄性健康大鼠70只，體重(200±20)g，隨機分為正常對照組(NC組)，癲癇模型組(PTZ組)，PTZ低劑量組(1.5 mg/kg，PL組)、中劑量組(4.0 mg/kg，PM組)、高劑量組(6.0 mg/kg，PH組)，每組14只。參照Morgan等〔1〕的方法并略加改動。PTZ用前以生理鹽水新鮮配制成溶液(10 g/L)，除NC組注射等量生理鹽水外，各組均給予PTZ(35 mg/kg，每日1次)腹腔注射，持續28 d；停藥1 w，再以相同劑量PTZ腹腔注射。PTZ以生理鹽水溶解分別配制成混懸液，PL、PM、PH組于注射PTZ前60 min分別灌胃(灌胃前禁食6 h)，NC組及PTZ組同時給予等體積的生理鹽水，每天1次，至處死大鼠前1 d。

1.3大鼠行為學觀察各組大鼠每日經上述處置后，均參考Racine等〔2〕為觀察行為變化的分級標準。癲癇大鼠發作的行為學變化的分級標準：0級：正常行為狀態；Ⅰ級：咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐，濕狗樣顫動；Ⅱ級：以點頭運動為主要表現的頸部肌肉的抽搐；Ⅲ級：前肢的陣攣、抽搐；Ⅳ級：雙側前肢伸直，伴有身體的立起；Ⅴ級：跌倒和全身驚厥。Ⅲ級以下為復雜部分發作，Ⅳ級和Ⅴ級為全身強直陣攣發作。注藥后即進行行為學觀察，如果在1 h內出現Ⅰ～Ⅴ級行為變化的歸為癲癇模型。

1.4取材處理在末次給藥次日處死大鼠，4℃取右腦海馬組織，保存于組織勻漿和液氮中備用，各組樣本行TLR4、NF-κB mRNA復合逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測。取左腦采用石蠟包埋組織化學技術，對各組切片行免疫組織化學染色，光學顯微鏡下觀察海馬組織病理學改變及TLR4、NF-κB蛋白表達情況。

1.5RT-PCR檢測海馬TLR4 、NF-κB mRNA表達海馬約50 mg，TRIzol法抽提總RNA，經DU-800紫外分光光度計檢測RNA含量。選取OD值1.8～2.2的總RNA(500 ng)為模板進行逆轉錄合成cDNA，然后PCR擴增，以β-actin為內參，引物由上海生工公司合成，PCR引物：TLR4上游5′-TGGCAGTTTCTGAGTAGCCG-3′,下游5′-GCTACTTCCTTGTGCCCTGT-3′,398 bp;NF-κB上游5′-ATGTTCGGTAGTGGCGGTG-3′,下游5′-CAGCATCTTCACATCTCCCGT-3′,524 bp;β-actin上游5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′,下游5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′,173 bp。反應條件：95℃預變性3 min；95℃30 s，退火溫度30 s，60℃(TLR4)/62℃(NF-κB)/58℃(β-actin)30 s，35個循環；72℃ 延伸10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶(DAB)染色，凝膠成像儀成像。采用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析結果，以TLR4、NF-κB與β-actin擴增產物光密度的比值反映表達水平。

1.6免疫熒光染色檢測TLR4、NF-κB取腦后，10%甲醛液(4℃)固定過夜，選擇海馬部位(前囟后2.8～4.5 mm水平)，冠狀切取厚3 mm 左右的組織，石蠟包埋。連續冠狀切片，厚度為5 μm，貼片、烤片后。進行免疫組化染色。按照SP及DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)步驟進行免疫組織化學染色，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。每只大鼠同一位置取5張切片，將切片置于顯微鏡下觀察大鼠海馬區神經元TLR4、NF-κB的表達。

1.7統計學處理采用SPSS17.0統計軟件進行方差分析。

2　結　果

2.1各組動物行為學觀察癲癇各組實驗動物在注射戊四氮后5～10 min內開始出現不同程度的癲癇發作，表現為節律性嘴部咀嚼樣運動、流涎和面部抽動，反復點頭運動、尾巴上翹，雙前上肢抬起陣攣，四肢抽搐，部分動物出現翻滾跳躍，進展為全身強直樣發作，每次發作持續時間為5～30 min不等，發作后完全緩解，個別達到點燃標準的動物可有自動驚厥發作，NC組大鼠均無癇性發作。

2.2各組大鼠海馬組織TLR4及NF-κB mRNA水平的變化TLR4及NF-κB在PTZ組表達顯著高于NC組(P<0.01)；而在PL組其表達低于PTZ組(P<0.05)；PM組二者表達低于PTZ、PL組(P<0.05)；PH組表達顯著調低且均低于PTZ、PL、PM組(P<0.05)。且治療各組大鼠大腦海馬區TLR4及NF-κB的表達隨著PTZ干預劑量增加而調低(P<0.05)。見表1，圖1、圖2。

表1　不同組別大鼠海馬中TLR4及NF-κB光密度值的比較

與NC組比較：1)P<0.01；與PTZ組比較：2)P<0.05；與PL組比較：3)P<0.05；與PM組比較：4)P<0.05，下表同

2.3免疫組化法檢測各組大鼠海馬組織TLR4及NF-κB蛋白表達變化TLR4在細胞質和胞膜上表達，呈黃色顆粒狀。在NC組中TLR4表達量較少；在PTZ組TLR4表達上調，與NC組相比差異顯著(P<0.01)；治療各組(PL、PM、PH組)與PTZ組相比TLR4表達量明顯減少(P<0.05)。NF-κB在細胞核中表達，呈黃色顆粒，在NC組中NF-κB表達量較少；在PTZ組中NF-κB表達上調，與NC組相比差異顯著(P<0.05)；治療各組(PL、PM、PH)與PTZ組相比，NF-κB表達量明顯減少(P<0.05)。見表2，圖3、圖4。

1～6:Marker,NC組、PTZ組、PL組、PM組、PH組，下圖同圖1　各組大鼠海馬組織TLR4 mRNA表達

圖2　各組大鼠海馬組織NF-κB mRNA表達

組別TLR4NF-κBNC組15.79±1.315.10±1.25PTZ組25.89±1.71)24.88±1.191)PL組21.91±1.32)4)22.59±0.912)4)PM組20.05±1.12)3)21.70±0.582)3)PH組18.90±1.02)3)4)17.40±1.252)3)4)

圖3　免疫組化法檢測各組大鼠海馬組織中TLR4的表達情況(DAB，×100)

圖4　免疫組化法檢測各組大鼠海馬組織中NF-κB的表達情況(DAB，×100)

3　討　論

不同的癲癇模型的動物實驗表明，癲癇后的腦損傷是慢性炎癥反應過程，免疫炎癥反應在癲癇發生與進程中起重要作用，即使沒有感染存在，細胞處于受損或應激狀態時所發出的信號也能引發免疫反應〔3〕，而具有抗驚厥特性的抗炎藥品在臨床和實驗中的使用與研究〔4〕，更加突現了大腦內的免疫炎性反應可能是構成癲癇反復發作的重要機制之一〔5〕，研究顯示，驚厥發作后即可激活腦內固有免疫細胞小膠質細胞，并釋放多種炎癥因子，從而引發并加劇炎癥反應，同時癲癇發作后常常伴有膠質結構的紊亂，這些因素均可促進形成興奮性病灶，癲癇腦損傷既是癲癇發作的結果，又是癲癇頻發和難治的原因。

TLR4通過識別結合相關的信號分子，最終引起NF-κB活化并進而誘導機體的免疫應答，在中樞神經系統中TLR4分布于星形膠質細胞和小膠質細胞〔6〕，并且近年來研究發現TLR4廣泛參與中樞神經系統疾病包括創傷性腦損傷、帕金森病、阿茲海默爾病等神經退行性疾病及腦缺血后神經損傷，這種損傷介導缺血后神經炎癥反應〔7，8〕。

NF-κB是啟動TLR4下游信號通路的中心環節，在TLR4信號傳導、免疫反應及炎癥相關因子及炎癥遞質之間釋放的級聯放大瀑布效應中起樞紐作用，當機體受到各種病理刺激后NF-κB發生核移位進入細胞核，與相應的靶序列結合，調控多種基因的表達，在炎癥反應、免疫應答的發生發展中發揮重要作用〔9〕。NF-κB的核移位在調控神經元突觸重塑的過程中扮演了“細胞因子”的角色并參與神經膠質疤痕的形成〔10〕。國內外研究均發現癲癇發作后引起腦組織不同程度的NF-κB激活，并于伴有海馬硬化的癲癇患者的齒狀回及周圍反應性星形膠質細胞的胞質和胞核中發現NF-κBp65呈過度表達〔11，12〕。因此認為NF-κB可能在癲癇發作中具有重要作用〔13〕。本實驗結果顯示，正常大鼠海馬區TLR4及NF-κB表達量極少，而PTZ組海馬區TLR4及NF-κB表達增多，推測該機制可能與反復癇性發作導致神經元缺血、缺氧、ATP耗竭，中樞神經系統微的環境改變，激活小膠質細胞，引起TLR4及其下游信號NF-κB激活，引起一系列炎癥級聯放大瀑布效應，提示TLR4/NF-κB信號通路介導的炎癥反應可能是慢性癲癇腦損傷形成的潛在機制之一。

PPARγ在炎癥、動脈粥樣硬化、胰島素抵抗、糖代謝、腫瘤中有重要的調節作用，并參與神經細胞程序性死亡，促進神經細胞的分化和成熟，并與神經細胞炎癥和氧化應激反應有關，PPARγ通過與NF-κB蛋白間相互作用，抑制NF-κB與炎癥介質基因啟動子區合，可抑制NF-κB介導炎癥介質TNF-α、IL-2的生成以發揮抗炎作用，另有研究表明在癲癇鼠模型中，PPARγ可抑制小膠質細胞的活性，阻止癲癇后的炎癥反應，減少神經細胞凋亡，起到神經保護作用〔14〕。PPARγ激動劑已被認為是TLR4的有效抑制劑〔15〕。PPARγ激動劑羅格列酮可以抑制由LPS誘導的TLR4信號和NF-κB的活化并可以調節TLR4信號轉導通路誘導的血管炎癥反應。

本研究說明PPARγ激動劑對大鼠癲癇發作后的神經元損傷具有保護作用，其機制可能是PPARγ激動劑可抑制TLR4信號通路的活化，從而影響其下游信號通路NF-κB的激活，另外PPARγ可直接抑制NF-κB的核移位及與靶基因DNA的結合，減少NF-κB調控的一系列細胞因子，進而對炎性因子的釋放發揮抑制作用。PPARγ激動劑PTZ可以通過抑制腦內炎性反應減少癲癇發作造成的腦損傷，減輕癲癇后的炎癥反應，減少神經細胞損傷，發揮潛在的神經保護作用。

1Morgan JI，Cohen DR，Hempstead JL，etal.Mapping pattern of c-fos expression in the central nervous system after seizure〔J〕.Science，1987；237(4811)：192-7.

2Racine RJ，Steingart M，Mc Intyre DC.Development of kindling-prone and kindling-resistant rats：selective breeding and electrophysiological studies〔J〕.Epilepsy Res，1999；35(3)：183-95.

3Song YS，Lee YS，Chan PH.Oxidative stress transiently decreases the IKKcom(IKKalpha，beta，and gamma)，an upstream component of NF-Kappa B signaling，after transient focal cerebral ischemia in mice〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2005；25(10)：1301-11.

4Vezzani A，Friedman A，Dingledine RJ.The role of inflammation in epileptogenesis〔J〕.Neuropharmacology，2013；69：16-24.

5Vezzani A，Maroso M，Balosso S,etal.IL-1 receptor/Toll-like receptor signaling in infection，inflammation，stress and neurodegeneration couples hyperexcitability and seizure〔J〕.Brain Behav Immun，2011；25(7)：1281-9.

6Laflamme N，Rivest S.Toll like receptor 4：the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cellwall components〔J〕.Mol Immunol,2005；42(2)：155-63.

7Faraco G，Fossati S，Bianchi ME，etal.High mobility group box 1 protein is released by neural cells upon different stresses and worsens ischemic neurodegeneration in vitro and in vivo〔J〕.Neurochem，2007；103(2)：590-603.

8Kim JB，Lim CM，Yu YM，etal.Induction and subcellular localization of high-mobility group box-1(HMGB1) in the postischemic rat brain〔J〕.Neurosci Res，2008；86(5)：1125-31.

9Hayden1 MS，Ghosh S.Shared principles in NF-κB signaling〔J〕.Cell，2008；132(3)：344-62.

10Albensi BC，Mattson MP.Evidence for the involvement of TNF and NF-kappa B in hippocampal synaptic plasticity〔J〕.Synapse，2000；35(2)：151-9.

11Crespel A，Coubes P，Rousset MC，etal.Inflammatory reactions in human medial temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis〔J〕.Brain Res，2002；952：159-69.

12王建平，曹亞芹，蘇怡凡.癲癎患兒外周血單個核細胞NF-κb活化的變化〔J〕.中國當代兒科雜志，2009，2009；11(1)：54-6.

13呂日瑯，徐曉云，趙永波.核因子-κB在癲癇中的作用〔J〕.臨床神經病學雜志，2012;25(6):469-70.

14Sun H，Huang Y，Yu X.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist，rosiglitazone，suppresses CD40 expression and attenuates inflammatory responses after lithium pilocarpine-induced status epilepticus in rats〔J〕.Int J Dev Neurosci,2008;26(5):505-15.

15Dasu MR，Park S，Devaraj S，etal.Pioglitazone inhibits Toll-like receptor expression and activity in human monocytes and db/db mice〔J〕.Endocrinology，2009；150：3457-64.

〔2014-12-03修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

劉蕾(1965-)，女，碩士，碩士生導師，主要從事癲癇發病機制研究。

金玉玲(1965-)，女，碩士，主任醫師，碩士生導師，主要從事神經系統疾病病理生理研究。

R749

A

1005-9202(2016)16-3890-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.009