腺病毒adv-hmepe質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染表達(dá)優(yōu)化

張慧明　魏　巍　劉　爽

(佳木斯大學(xué)，黑龍江　佳木斯　154002)

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腺病毒adv-hmepe質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染表達(dá)優(yōu)化

張慧明魏巍劉爽

(佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154002)

目的構(gòu)建人細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(hmepe)基因的重組腺病毒pYr-ads-4-hMEPE真核表達(dá)載體，并優(yōu)化其轉(zhuǎn)染條件。方法構(gòu)建腺病毒包裝質(zhì)粒pYr-ads-4-hMEPE，在HEK293細(xì)胞中包裝形成腺病毒顆粒，轉(zhuǎn)染前列腺上皮細(xì)胞株RWPE1，同時(shí)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為對(duì)照細(xì)胞株。設(shè)置腺病毒重組質(zhì)粒梯度檢測(cè)最佳轉(zhuǎn)染濃度，免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中MEPE蛋白表達(dá)水平，確定轉(zhuǎn)染效果。共聚焦顯微鏡檢測(cè)不同條件下的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果經(jīng)酶切與測(cè)序驗(yàn)證，pYr-ads-4-hMEPE重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，免疫印跡分析驗(yàn)證轉(zhuǎn)染rAd-4-hMEPE的RWPE1細(xì)胞株中MEPE蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而轉(zhuǎn)染相應(yīng)空載體的細(xì)胞株中MEPE蛋白的表達(dá)水平與野生型細(xì)胞株一致，說明腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功可在真核細(xì)胞表達(dá)，共聚焦檢測(cè)分析質(zhì)粒濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率可信度較好。結(jié)論成功構(gòu)建hmepe真核表達(dá)載體，重組腺病毒轉(zhuǎn)染RWPE1細(xì)胞最佳融合比例1.25∶1 000，即質(zhì)粒量為1.25 μl加入1 ml培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)染效率最佳。

腺病毒；轉(zhuǎn)染；優(yōu)化

病毒載體作為基因治療技術(shù)的手段被廣泛應(yīng)用〔1〕，通過對(duì)病毒基因組的改造，使之能夠攜帶外源目的基因和相關(guān)的病毒元件，并被包裝成病毒顆粒。病毒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使攜帶的外源基因在宿主體內(nèi)表達(dá)〔2〕，其中腺病毒質(zhì)粒是常用的真核表達(dá)載體。腺病毒不會(huì)將外源基因插入目的基因組，雖不能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，只能瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，但操作安全性優(yōu)于慢病毒，因此廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。通常腺病毒轉(zhuǎn)染效率較高并可以轉(zhuǎn)染任何細(xì)胞株，但實(shí)際應(yīng)用中需要優(yōu)化條件，以達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染結(jié)果且減少病毒使用量，增加安全性〔3〕。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了腺病毒人細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(hmepe)真核表達(dá)質(zhì)粒，并研究其最佳轉(zhuǎn)染條件，為研究MEPE在前列腺癌細(xì)胞中的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料前列腺上皮細(xì)胞RWPE1、人胚腎細(xì)胞NHK293購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)克隆載體pYr-adshuttle-4以及Adenovirus Expression System重組腺病毒構(gòu)建體系均購自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司；PCR酶、限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；T4 DNA Ligase購自NEB公司；Marker Ⅳ購自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，普瑞麥格生物技術(shù)有限公司自產(chǎn)；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)；引物合成、測(cè)序均在上海英駿生物技術(shù)有限公司完成；細(xì)胞培養(yǎng)常用材料與耗材等。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建pYr-ads-4-hMEPE質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)室保存人MEPE蛋白的cDNA序列質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增。上游引物PRIMER1：GTG AAT AAA GAA TAT AGT ATC AGT；下游引物PRIMER2：CTA GTC ACC ATC GCT CTC ACT。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 1 min 40 s，72℃ 7 min，30個(gè)循環(huán)。膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒pYr-adshuttle-4載體和插入片段hmepe分別用NheⅠ、HindⅢ雙酶切。酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選1～2陽性克隆酶切測(cè)序鑒定。

1.2.2構(gòu)建腺病毒質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞取pYr-ads-4-mMEPE 3 μl、pAd/PL-DEST(0.25 μg/μl)0.5 μl、LR Clonase Ⅱ 2 μl，25℃，1 h。加入蛋白酶K 1 μl，37℃，15 min得重組腺病毒質(zhì)粒。用PacⅠ酶切重組腺病毒質(zhì)粒，37℃水浴反應(yīng)3 h。酶切后產(chǎn)物中加70 μl TE緩沖液(pH 8.0)及100 μl酚、氯仿、異戊醇的混合物，混勻。15 000 r/min離心5 min，取上清至干凈的1.5 ml EP管中。加入3 mol/L乙酸鈉(NaOAc) 10 μl，混勻，加入350 μl 無水乙醇，混勻。-80℃冷凍15 min，15 000 r/min離心15 min。70%酒精洗滌2遍，用10 μl H2O充分溶解。使用 METAFECTENETM(Biontex公司) lipid，將DNA與lipid融合，對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)期HEK 293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24 h后，換培養(yǎng)基為10%胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染3 d，每天觀察細(xì)胞病態(tài)反應(yīng)(CPE)，>50%細(xì)胞脫壁時(shí)即收細(xì)胞進(jìn)行裂解收病毒。測(cè)定病毒滴度為TCID50=10-4.2/100 μl 病毒。

1.2.3病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞RWPE1接種于6孔培養(yǎng)板中，分別鋪3個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)染腺病毒質(zhì)粒，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入無血清培養(yǎng)基病毒顆粒混合液，1 ml無血清培養(yǎng)基中分別加入0.5、1.25、2.5、3.75、5 μl病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6 h后換為正常培養(yǎng)基，24 h后得到轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，激光共聚焦顯微鏡觀察。隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野下確定DAPI染色的細(xì)胞總數(shù)，然后確定MEPE高表達(dá)的激發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)。計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染率=綠色熒光細(xì)胞(個(gè))/藍(lán)色細(xì)胞核(個(gè))×100%。

1.2.4免疫印跡檢測(cè)MEPE蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中表達(dá)情況取指數(shù)生長(zhǎng)期RWPE1細(xì)胞，按1.2.3步驟操作，種板、轉(zhuǎn)染，離心收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞抽提蛋白。然后加入等體積的2×上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，電泳轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶封閉1 h，一抗室溫結(jié)合1 h，洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫結(jié)合1 h，洗膜后加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色液作用3 min，壓片顯影。

2　結(jié)　果

2.1經(jīng)酶切與測(cè)序驗(yàn)證pYr-ads-4-mMEPE重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，載體7 015 bp,目的片段1 575 bp。見圖1。

2.2腺病毒重組質(zhì)粒與細(xì)胞液的比例對(duì)轉(zhuǎn)染率的影響不同質(zhì)粒的量分別加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，隨著加入質(zhì)粒量的升高，轉(zhuǎn)染率逐漸增大，1.25 μl時(shí)轉(zhuǎn)染效率最佳，增加病毒量轉(zhuǎn)染率無明顯變化；但達(dá)到5 μl時(shí)細(xì)胞大量死亡。見圖2，表1。

圖1　酶切驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建pYr-ads-4-mMEPE瓊脂糖電泳圖

圖2　共聚焦檢測(cè)腺病毒重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

2.3免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染rAd-4-hMEPE的RWPE1細(xì)胞株蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)染相應(yīng)空載體的細(xì)胞株中MEPE蛋白表達(dá)水平與野生型細(xì)胞株一致，說明腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功并可在真核細(xì)胞表達(dá)。隨著質(zhì)粒量的不同，轉(zhuǎn)染效率不同；質(zhì)粒0.5 μl時(shí)轉(zhuǎn)染率較低，1.25 μl時(shí)較高，隨后增加質(zhì)粒的量轉(zhuǎn)染效率無顯著性差異。成功構(gòu)建hmepe真核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒的量為1.25 μl時(shí)轉(zhuǎn)化率最佳。見圖3。

圖3　Western印跡檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞株中MEPE蛋白表達(dá)趨勢(shì)

表1　不同腺病毒重組質(zhì)粒量對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響±s)

3　討　論

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，是男性發(fā)病率較高的癌癥之一〔4〕。前列腺癌發(fā)病隱匿，早期易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，給診斷與根治帶來困難，患者常以骨轉(zhuǎn)移癥狀為首次就診原因。MEPE蛋白作為分泌蛋白分布在細(xì)胞外基質(zhì)中，含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，具有類胰島素因子的活性〔5〕，與成骨性骨轉(zhuǎn)移有關(guān)，但因轉(zhuǎn)染表達(dá)效率低影響對(duì)MEPE蛋白功能的研究。

腺病毒載體的特點(diǎn)是宿主范圍廣，對(duì)人致病性低，在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因，能有效進(jìn)行增殖，滴度高，可以通過不同的途徑感染所有細(xì)胞類型，不整合到染色體中，無插入致突變性，不會(huì)影響目的基因的長(zhǎng)期表達(dá)，能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增，相對(duì)穩(wěn)定易于濃縮與純化，能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因，這些優(yōu)勢(shì)使腺病毒成為外源基因轉(zhuǎn)染機(jī)體細(xì)胞的表達(dá)載體，廣泛應(yīng)用于各種基因治療。但是，作為載體腺病毒還有許多不足之處，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生免疫性反應(yīng)，使重復(fù)感染失效〔6〕；另外，其毒性較大，用作轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)需要對(duì)其毒性進(jìn)行檢測(cè)〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)在RWPE1細(xì)胞株用rAD-4-hMEPE重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，隨著重組質(zhì)粒的提高，轉(zhuǎn)染率逐漸增大，當(dāng)量為1.25 μl時(shí)轉(zhuǎn)染率最佳，隨后細(xì)胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染率下降，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。可見轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量不可以過大，細(xì)胞會(huì)因毒性太大而脫落。免疫印跡結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染rAd-4-hMEPE的RWPE1細(xì)胞株上調(diào)MEPE蛋白表達(dá)，生長(zhǎng)形態(tài)良好。重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，當(dāng)質(zhì)粒量達(dá)到1.25 μl時(shí)轉(zhuǎn)染效率明顯增高，繼續(xù)增加質(zhì)粒量轉(zhuǎn)染效率沒有太大變化。成功構(gòu)建hmepe真核表達(dá)質(zhì)粒是研究前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的前期試驗(yàn)，MEPE 表達(dá)可對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移做出預(yù)測(cè)，為惡性腫瘤基因治療奠定基礎(chǔ)。而且，檢測(cè)MEPE的表達(dá)水平還可監(jiān)測(cè)腫瘤治療的預(yù)后，為腫瘤基因治療提供新的靶點(diǎn)。

1Wu TL，Zhou DM.Viral delivery for gene therapy against cell movement in cancer〔J〕.Adv Drug Deliv Rev，2011；63(8)：671-7.

2Miller AD.Cationic liposome systems in gene therapy〔J〕.Drugs，1998;1(5)：574-83.

3Barouch DH，Alter G,Broge T,etal.Protective efficacy of adenovirus-protein vaccines against SⅣ challenges in rhesus monkeys〔J〕.Science，2015；349(6245)：320-4.

4Arterburn D，Wellman R，Westorook ED,etal.Decision aids for benign prostatic hyperplasia and prostate cancer〔J〕.Am J Manag Care，2015；21(2)：e130-40.

5Wilmott RW，Amin RS，Perez CR，etal.Safety of adenovirus-mediated transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cDNA to the lungs of nonhuman primates〔J〕.Hum Gene Ther，1996；7(3)：301-18.

6Landin AM，Kim JW，Chaudhari N.Liposome-mediated transfection of mature taste cells(J).J Neurobiol，2005；65(1)：12-21.

7Drezner MK，Quarles LD，Mundy GR.MEPE has the properties of an osteoblastic phosphatonin and minhibin〔J〕.Bone，2004；34(2)：303-19.

〔2016-05-09修回〕

(編輯袁左鳴)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31471213)；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.D201208)；佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目(No.Sz2013-003)；佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目理科面上 (No.LM2014_002)

劉爽 (1975-)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究。

張慧明(1981-)，女，碩士，主要從事腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究。

R735.7

A

1005-9202(2016)16-3901-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.014