表沒食子兒茶素沒食子酸酯對脂多糖誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用

陳　華　苗加偉　李　晶　郝　坡

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶　404120)

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表沒食子兒茶素沒食子酸酯對脂多糖誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用

陳華苗加偉李晶1郝坡

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶404120)

目的觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對細(xì)菌脂多糖(LPS) 所致大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用。方法取新生乳鼠原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，利用LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)。熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化自由基的水平；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和Western 印跡檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-8、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、炎性因子蛋白含量的變化。結(jié)果LPS激活神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)其釋放超氧化自由基，誘導(dǎo)炎癥因子的過度表達(dá)，大幅上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-8炎性因子和升高iNOS蛋白質(zhì)水平(P<0.05)，EGCG明顯抑制超氧化自由基及上述炎癥因子的過度產(chǎn)生，減輕LPS對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的毒性。結(jié)論EGCG能減弱LPS引起的體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

EGCG；脂多糖；炎癥；神經(jīng)保護(hù)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)具有預(yù)防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用〔1,2〕。近年研究證實(shí)EGCG具有一定抗炎活性〔3～7〕。目前，EGCG對原代培養(yǎng)的腦膠質(zhì)細(xì)胞抗炎作用產(chǎn)生保護(hù)尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)菌脂多糖(LPS)引起大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞急性炎癥模型，觀察EGCG對神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的作用和機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物出生1～2 d的SD乳鼠，重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(渝) 20022007。

1.2藥品及試劑EGCG購自重慶市卓諾生物技術(shù)有限公司；血清、LPS、氨基酸對照品及超氧化自由基檢測試劑盒購于美國Sigma公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自美國R&D公司；所有一抗和二抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3儀器設(shè)備二氧化碳注入式電熱恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Electron 公司)；超凈工作臺(蘇州精華設(shè)備公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；96孔板清洗儀、酶標(biāo)儀。

1.4方法

1.4.1大鼠原代膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)取新生SD小鼠，75%乙醇皮膚消毒5 min后斷頭，眼科剪開顱取腦，游離兩側(cè)大腦皮質(zhì)置于D-Hank溶液浸潤，用鑷子剝離腦膜和血管，0.25%胰酶消化制成懸液。懸液過200目鋼網(wǎng)后1 500 r/min離心3 min，分離后添加DMEM培養(yǎng)基加滅活后微孔濾膜過濾10%胎牛血清培養(yǎng)液，吸取細(xì)胞液接種24孔板，滴加青霉素/鏈霉素(100 U/L)，調(diào)整細(xì)胞密度約為1×105/孔。培養(yǎng)皿放入5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)48 h后換液清洗一次，持續(xù)培養(yǎng)7～10 d至細(xì)胞長滿融合備用。

1.4.2分組及加藥處理實(shí)驗(yàn)分為：①空白對照組；②LPS(10 μg/L)組；③20 μmol/L EGCG；④40 μmol/L EGCG；⑤80 μmol/L EGCG。 每組6孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 5 次。空白對照組細(xì)胞每孔分別加入等量DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其他組膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)皿中預(yù)先加入EGCG溶液作用24 h，再加入LPS作用2 h。前期細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)二甲基亞砜(DMSO)濃度<0.05%對膠質(zhì)細(xì)胞無明顯毒性反應(yīng)，藥物EGCG采用DMSO溶解，所得混懸液再用DMEM培養(yǎng)液稀釋，配置成EGCG標(biāo)準(zhǔn)液。

1.4.3MTT比色法檢測細(xì)胞活力及胞內(nèi)超氧化自由基的測定膠質(zhì)細(xì)胞以1×105/孔的密度接種96孔板，加入MTT染色劑噻唑藍(lán)(6 mg/ml)孵育4 h，滴加DMSO，震蕩后用全自動酶標(biāo)儀測定570 nm處OD值并減去空白OD值；此外，用485、530 nm雙波長激發(fā)，按試劑盒的說明利用二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA) 作為熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化自由基的含量。

1.4.4炎性因子測定經(jīng)過EGCG處理的細(xì)胞，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA試劑盒的說明測定細(xì)胞培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-8含量變化。裂解液處理加藥膠質(zhì)細(xì)胞，15 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法蛋白定量，Western印跡測定誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表達(dá)情況。β-actin作為內(nèi)參對照，比較不同組細(xì)胞蛋白表達(dá)差異。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1EGCG細(xì)胞對MTT及超氧化自由基的影響與空白對照組比較，在LPS處理的膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)模型中，超氧化自由基的產(chǎn)量顯著增加(240%)，OD值明顯降低(63%)。與LPS組比較，預(yù)先用EGCG(20、40、80 μmol/L) 處理的細(xì)胞中超氧化自由基的產(chǎn)量明顯降低，抑制率分別為26%、33%和37%。EGCG處理組OD值與劑量呈正相關(guān)，以空白對照組OD值為參照，分別為68.5%、75.3%和88.9%(均P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著提高。

2.2不同劑量EGCG對膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子水平的影響LPS明顯刺激TNFα、IL-1β、IL8大量釋放；與LPS組比較，不同濃度EGCG均能明顯減少上清液中炎癥因子的含量，且這一抑制作用與EGCG濃度呈正相關(guān)。見表1。

2.3Western 印跡分析結(jié)果與空白對照組比較，LPS誘導(dǎo)iNOS蛋白表達(dá)明顯增加；與LPS組比較，不同濃度的EGCG均能夠抑制iNOS的蛋白表達(dá)。見圖1。

表1　EGCG對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子水平的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05，與LPS組比較：2)P<0.05

A.空白對照組；B.LPS組；C.20 μmol/L EGCG組；D.40 μmol/L EGCG組；E.80 μmol/L EGCG組圖1　EGCG對細(xì)胞內(nèi)iNOS蛋白表達(dá)水平的影響

3　討　論

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的關(guān)系密切，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與神經(jīng)元凋亡具有很強(qiáng)的相關(guān)性。許多神經(jīng)退行性疾病中都顯示出神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和死亡。LPS誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，模擬在人體內(nèi)發(fā)生的上述炎性反應(yīng)變化，誘發(fā)神經(jīng)元的凋亡，此作用類似于慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷中引起神經(jīng)元死亡的過程。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用LPS引起大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，驗(yàn)證了EGCG的抗炎作用。EGCG能明顯抑制細(xì)菌LPS誘導(dǎo)的炎癥因子如TNF-α、IL-8、IL-1β和iNOS的過度表達(dá)，從而減輕炎癥因子的毒性作用。EGCG通過多靶點(diǎn)機(jī)制〔8,9〕對中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病具有防治作用〔10〕，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)它是茶多酚抗炎作用的有效成分之一，這也進(jìn)一步證實(shí)了其他學(xué)者對EGCG體外抗炎作用的研究〔11,12〕。

TNF-α是創(chuàng)傷或感染等病理?xiàng)l件下最早產(chǎn)生的功能細(xì)胞因子之一，它可刺激IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥介質(zhì)，并能協(xié)同擴(kuò)大其生物學(xué)效應(yīng)。增高的IL-1β參與腦水腫的形成，血腦屏障的破壞并進(jìn)一步誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)造成神經(jīng)細(xì)胞的毒性，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和死亡，EGCG可以減輕損傷增加細(xì)胞存活率，這一結(jié)果與國外研究一致〔13〕。LPS模擬病理過程下激活一氧化氮合酶(NOS)mRNA表達(dá)增加，誘導(dǎo)iNOS水平及活性明顯增高，促進(jìn)一氧化氮(NO)合成，血管內(nèi)皮通透性增加，炎性加重，而EGCG通過抑制iNOS活化，減輕了炎性損傷程度。

綜上所述，EGCG是茶多酚發(fā)揮抗炎作用的有效成分之一，具有抑制炎癥因子的過度表達(dá)，減輕LPS引發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的作用。本研究結(jié)果增加了EGCG對抗炎的認(rèn)識，拓寬了人們對EGCG用于心腦血管保護(hù)藥理作用機(jī)制的理解〔14,15〕。

1Singh BN,Shankar S,Srivastava RK.Green tea catechin,epigallocatechin-3-gallate(EGCG):mechanisms,perspectives and clinical applications〔J〕.Biochem Pharmacol，2011；82(12):1807-21.

2Singh R,Akhtar N,Haqqi TM.Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate:inflammation and arthritis〔J〕.Life Sci，2010；86(25-26):907-18.

3張惠燕，王劍勇，姚航平.表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制脂多糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)與分泌趨化因子的表達(dá) 〔J〕.生理學(xué)報,2014；66(2):145-50.

4杜玉,婁紅祥.表沒食子兒茶素沒食子酸酯藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.國外醫(yī)藥(植物藥冊)，2006；21(6):244-9.

5鄧鳳君，楊迎暴，徐江平，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對脊髓損傷大鼠炎癥因子釋放及神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010；16(7):195-8.

6Bae HB,Li M,Kim JP,etal.The effect of epigallocatechin gallate on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in a murine model〔J〕.Inflammation，2010；33(2):82-91.

7Joo SY,Song YA,Park YL,etal.Epigallocatechin-3-gallate inhibits LPS-induced NF-κB and MAPK signaling pathways in bone marrow-derived macrophages〔J〕.Gut Liver,2012；6(2):188-96.

8Chen D,Milacic V,Chen MS,etal.Tea polyphenols,their biological effects and potential molecular targets〔J〕.Histol Histopathol，2008；23(4):487-96.

9Pae M,Wu D.Immunomodulating effects of epigallocate-chin-3-gallate from green tea:mechanisms and applications〔J〕.Food Funct，2013；4(9):1287-303.

10Hǜgel HM,Jackson N.Redox chemistry of green tea polyphenols:therapeutic benefits in neurodegenerative diseases〔J〕.Mini Rev Med Chem,2012；12(5):380-7.

11El-Mowafy AM,Al-Gayyar MM,Salem HA,etal.Novel chemotherapeutic and renal protective effects for the green tea (EGCG):role of oxidative stress and inflammatory-cytokine signaling〔J〕.Phytomedicine,2010;17(14):1067-75.

12張東芳，肖鵬，韓晨露，等.表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎因子TNF-α和IL-1β基因表達(dá)〔J〕.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2014；30(4)：402-8.

13Itoh T,Imano M,Nishida S,etal.Epigallocatechin-3-gallate increases the number of neural stem cells around the damaged area after rat traumatic brain injury〔J〕.J Neural Transm,2012,119(8):877-90.

14Andrade JP,Assunc?o M.Protective effects of chronic green tea consumption on age-related neurodegeneration〔J〕.Curr Pharm Des,2012；18(1):4-14.

15葛建，林芳，李明揆，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)生物活性研究進(jìn)展〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011；38(2):156-63.

〔2015-02-16修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2014jcyjA10049)；重慶市高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃(2014年)

郝坡(1980-)，男，碩士，副教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

陳華(1965-)，男，副教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

R285

A

1005-9202(2016)16-3913-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.019

1三峽中心醫(yī)院