內質網應激激活劑通過上調GRP78增加肺癌A549細胞對順鉑的敏感性

石少敏　趙建軍　趙鳳芹　王　靜

(吉林大學中日聯誼醫院呼吸內科，吉林　長春　130033)

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內質網應激激活劑通過上調GRP78增加肺癌A549細胞對順鉑的敏感性

石少敏趙建軍趙鳳芹王靜

(吉林大學中日聯誼醫院呼吸內科，吉林長春130033)

目的探討內質網應激激活劑(TM)增加肺癌A549細胞對順鉑(DDP)敏感性的機制。方法DDP和TM處理肺癌A549細胞，MTT法檢測肺癌A549細胞存活率，流式細胞術檢測細胞凋亡水平，Western印跡檢測凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-7表達。結果不同濃度的DDP(0，10，20，50 μmol/L)作用于肺癌A549細胞24 h，細胞存活率以劑量依賴的方式下降；TM誘導內質網應激后，提高了DDP(20 μmol/L)誘導的細胞凋亡率(55.23%±2.31%，P<0.05)；同時檢測到凋亡相關蛋白Caspase-7表達增加。結論DDP能夠誘導肺癌A549細胞凋亡，但是TM通過上調GRP78增加了肺癌A549細胞對DDP敏感性，聯合應用TM和DDP有望成為治療肺癌的新策略。

內質網應激；順鉑；凋亡；肺癌

順鉑(DDP)通過損傷細胞的DNA而發揮抗腫瘤作用〔1〕，可用于治療卵巢癌、頭頸部的腫瘤和肺癌等〔2〕，其治療腫瘤的主要障礙是藥物耐受〔3〕。新近報道，線粒體通路和內質網應激參與了DDP誘導的癌癥細胞的凋亡〔4〕。同時，有研究顯示，在人黑色素瘤和結腸癌細胞中，DDP通過影響內質網中的鈣穩態而誘導內質網應激，進而導致癌癥細胞凋亡〔5〕。當缺氧、DNA損傷、細胞內的鈣紊亂時，誘導癌癥細胞發生內質網應激。葡萄糖相關蛋白(GRP78)是細胞的內質網蛋白，當內質網應激發生時表達上調，并進一步活化內質網上橫跨膜蛋白質傳感器ATF6、IRE1、PERK〔6〕。有研究報道，在肺癌A549細胞中，GRP78上調能夠增強腫瘤細胞對DDP的敏感性〔7〕。本研究旨在觀察DDP作用于肺癌A549細胞前后細胞凋亡的變化，以及聯合內質網應激激活劑TM對細胞凋亡產生的影響，并初步探討其相關機制。

1　材料與方法

1.1細胞培養將人肺癌A549細胞用含10%胎牛血清、雙抗(100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素)的RPMI-1640培養液(Gibco公司)，在37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。

1.2實驗方法

1.2.1MTT法檢測細胞活力取生長狀態良好的對數生長期肺癌細胞接種至96孔板，待細胞完全貼壁，加入既定濃度的DDP和(或)TM，每孔200 μl的終體積液體，每組設6個復孔，藥物干預作用24 h后，每孔加入20 μl噻唑藍(MTT)溶液(5 g/L)，將細胞在培養箱繼續培養4～6 h。棄去培養基，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)于每孔內，振蕩搖勻后，用酶標儀于490 nm波長測定各孔的吸光度值，計算細胞的生存率。

1.2.2流式細胞儀技術檢測細胞凋亡率 取生長狀態良好的肺癌A549細胞，將細胞接種于6孔板，培養24 h后，換液并按既定濃度的DDP和(或)TM處理細胞，藥物干預24 h后收集懸浮，并用胰酶消化貼壁細胞，加入400 μl結合緩沖液使細胞重懸，之后加入AnnexinV和PI溶液，于室溫條件下避光孵育15 min；通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率，每組實驗重復3次。

1.2.3Western印跡檢測凋亡相關蛋白表達取生長狀態良好的肺癌A549細胞，接種于細胞培養瓶，細胞貼壁后分別加入既定濃度的DDP和(或)TM處理細胞，藥物干預24 h后，收集貼壁細胞和懸浮細胞，提取細胞蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)方法將蛋白進行定量。并使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)膠(200 V，45 min)進行電泳，之后用100 V轉膜1 h，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，同時含15%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉2 h，用PBS洗滌3次，之后加入相應一抗，經4℃孵育過夜后，用PBS洗滌3次15 min、5 min、5 min后，加入辣根過氧化酶標記的二抗孵育2 h(Caspase-7抗體稀釋比例1∶100、β-actin抗體稀釋比例1∶1 000、二抗稀釋比例1∶1 000)，之后再用PBS洗滌3次，使用增強化學發光法(ECL)進行顯影，之后再用凝膠成像系統分析條帶的灰度值。

1.3統計學方法采用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2　結　果

2.1不同濃度的DDP對肺癌A549細胞活力及凋亡的影響0，10，20，50 μmol/L的DDP干預24 h后，MTT結果顯示，隨著藥物濃度的增加，其對A549細胞生長抑制作用逐漸增加，細胞存活率分別為(1±0.066)、(0.74±0.11)、(0.52±0.054)、(0.32±0.021)；并且隨著藥物濃度的逐漸增加，A549細胞逐漸皺縮，而且脫離貼壁的現象明顯增加。10，20，50 μmol/L的DDP作用A549細胞24 h后，流式細胞術檢測A549細胞凋亡分別為(2.14±0.68)%，(8.67±0.69)%，(13.16±1.11)%，(19.22±1.65)%。

2.2DDP誘導的肺癌A549細胞凋亡相關蛋白的表達水平0，10，20，50 μmol/L的DDP作用A549細胞24 h后，凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-7的表達水平隨著藥物濃度增加而上調，分別為0.04±0.023，0.73±0.28，1.33±0.079，1.67±0.121,尤其DDP濃度在20，50 μmol/L時，與對照組相比，Cleaved Caspase-7的表達水平增加更明顯。見圖1。

2.3TM對內質網應激相關蛋白GRP78表達水平的影響0，1，2，4 μg/ml TM作用A549細胞24 h后，內質網應激相關蛋白GRP78的表達水平逐漸增加，分別為0.23±0.058、0.49±0.11、0.62±0.062、0.79±0.077，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。見圖2。

2.4TM聯合DDP對肺癌A549細胞存活率的影響1 μg/ml TM聯合20 μmol/L DDP處理A549細胞24 h后，與對照組(1±0.18)相比，單加1 μg/ml TM組細胞生存率(0.95±0.075)無明顯差異。DDP組(0.55±0.068)和二者聯合組(0.24±0.03)的細胞存活率均明顯降低，尤其二者聯合組的細胞生存率明顯低于單加DDP組(P<0.05)，提示TM促進了順鉑對A549細胞生存率的影響。

2.5TM促進DDP誘導肺癌A549細胞凋亡TM聯合DDP處理肺癌A549細胞24 h后，流式結果顯示，與對照組〔(2.6±0.062)%〕相比，單加1 μg/ml TM組肺癌A549細胞凋亡率〔(3.3±0.17)%〕無明顯差異(P>0.05)；而20 μmol/L DDP組〔(10.21±0.32)%〕和二者聯合組〔(18.69±1.12)%〕的細胞凋亡率均明顯增加，尤其在二者聯合組細胞凋亡率增加更明顯(P<0.05)，提示TM促進了DDP誘導的肺癌A549細胞凋亡率的增加。

2.6TM影響DDP誘導的肺癌A549細胞凋亡相關蛋白的表達TM聯合DDP處理肺癌A549細胞24 h后，與對照組(0.03±0.02)相比，單加TM細胞凋亡相關蛋白Caspase-7的表達(0.043±0.031)無明顯的變化(P>0.05)；與單加DDP組(0.32±0.06)比較，二者聯合組Caspase-7表達(0.71±0.054)明顯升高(P<0.05)，見圖3。

圖1　DDP誘導的肺癌細胞凋亡相關蛋白的表達水平

圖2　TM對肺癌細胞內質網應激相關蛋白的表達水平

圖3　聯合應用對A549細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響

3　討　論

目前研究發現內質網應激在化療藥物誘導的肺癌凋亡中起到了重要的作用〔8〕。在以前的研究中，內質網應激被認為是一種生物學的級聯反應，能夠有效誘導細胞凋亡；事實上，內質網應激是對許多刺激因素如生物化學、病理及生理條件下的刺激產生的一種細胞反應，能夠促發各種細胞功能紊亂包括錯誤折疊蛋白質的聚集和Ca2+穩態的改變〔9〕。并且在過度的內質網應激和凋亡性的細胞死亡之間的關系已經在巨噬細胞、神經細胞和內皮細胞，以及癌癥細胞都已得到了證實〔10〕。在本研究中，也發現TM增強了肺癌細胞對DDP的敏感性。GRPs是內質網分子伴侶，普遍存在內質網中，能夠輔助蛋白質的折疊〔11〕。GRP78(也被成為Bip)是典型的GRPs家族成員，是和細胞質中的熱休克蛋白(HSP)70和90同源，并且一般被大家認為是內質網應激的分子標志〔12〕。在內質網應激發生時，GRP78表達水平明顯上調。在本研究中也顯示，在肺癌A549細胞中，TM能夠劑量依賴性上調GRP78的表達，并且，當TM和DDP聯合應用時，能夠有效抑制肺癌A549細胞的生存率，同時明顯增加肺癌A549細胞的凋亡率及凋亡相關蛋白Caspase-7的表達。

1Holford J，Beale PJ，Boxall FE，etal.Mechanisms of drug resistance to the platinum complex ZD0473 in ovarian cancer cell lines〔J〕.Eur J Cancer，2000;36(15)：1984-90.

2Zhao J，Kim JE，Reed E，etal.Molecular mechanism of antitumor activity of taxanes in lung cancer(Review)〔J〕.Int J Oncol，2005；27(1)：247-56.

3Perego P，Gatti L，Righetti SC，etal.Development of resistance to a trinuclear platinum complex in ovarian carcinoma cells〔J〕.Int J Cancer，2003;105(5)：617-24.

4Di Sano F，Ferraro E，Tufi R，etal.Endoplasmic reticulum stress induces apoptosis by an apoptosome-dependent but caspase 12-independent mechanism〔J〕.J Biol Chem，2006;281(5)：2693-700.

5Mandic A，Hansson J，Linder S，etal.Cisplatin induces endoplasmic reticulum stress and nucleus-independent apoptotic signaling〔J〕.J Biol Chem，2003;278(11)：9100-6.

6Schroder M，Kaufman RJ.The mammalian unfolded protein response〔J〕.Annu Rev Biochem，2005;74(7)：739-89.

7Ahmad M，Hahn IF，Chatterjee S.GRP78 up-regulation leads to hypersensitization to cisplatin in A549 lung cancer cells〔J〕.Anticancer Res，2014;34(7)：3493-500.

8Zhao Y，Zhu C，Li X，etal.Asterosaponin 1 induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in A549 human lung cancer cells〔J〕.Oncol Rep，2011;26(4)：919-24.

9Madeo F，Kroemer G.Intricate links between ER stress and apoptosis〔J〕.Mol Cell，2009;33(6)：669-70.

10Tan Y，Dourdin N，Wu C，etal.Ubiquitous calpains promote caspase-12 and JNK activation during endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis〔J〕.J Biol Chem，2006;281(23)：16016-24.

11Gething MJ，Sambrook J.Protein folding in the cell〔J〕.Nature，1992;355(6355)：33-45.

12Lee AS.The glucose-regulated proteins：stress induction and clinical applications〔J〕.Trends Biochem Sci，2001;26(8)：504-10.

〔2015-12-11修回〕

(編輯袁左鳴)

王靜(1976-)，女，副主任醫師，主要從事慢性阻塞性肺疾病研究。

石少敏(1981-)，女，主治醫師，主要從事肺癌診治的基礎研究。

R453

A

1005-9202(2016)16-3925-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.025