曲美他嗪與雷米普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及bax、bcl-2蛋白表達的影響

馮翔宇　李秀華　謝亞芹　彭玉娟　康大偉

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北　承德　067000)

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1承德醫(yī)學院

曲美他嗪與雷米普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及bax、bcl-2蛋白表達的影響

馮翔宇李秀華謝亞芹1彭玉娟康大偉

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

目的觀察曲美他嗪與雷米普利單用及聯(lián)合用藥對慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌細胞凋亡程度及凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2蛋白表達的影響。方法雄性Wistar大鼠50只，隨機分為模型組、曲美他嗪組、雷米普利組、聯(lián)合用藥組，用腹主動脈縮窄法復(fù)制CHF模型，另取假手術(shù)組作為對照，每組10只大鼠。觀察和比較各組大鼠左心室重量指數(shù)(LVMI)及心功能，原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測心肌細胞凋亡指數(shù)，SP免疫組化法檢測各組大鼠bax、bcl-2蛋白的表達情況，用RT-PCR法測定各組大鼠bax mRNA及bcl-2 mRNA的表達水平。結(jié)果與模型組比較，藥物干預(yù)組大鼠心功能明顯改善，凋亡指數(shù)明顯降低，bcl-2陽性表達及其mRNA水平顯著升高， bax陽性表達及其mRNA水平顯著降低，其中以聯(lián)合用藥組變化最顯著。結(jié)論曲美他嗪與雷米普利單用及聯(lián)合應(yīng)用均可有效改善心功能、抑制細胞凋亡、延緩CHF，聯(lián)合用藥在抗心肌細胞凋亡方面的療效優(yōu)于單獨用藥。

心力衰竭;細胞凋亡;曲美他嗪;bax;bcl-2

心肌細胞凋亡是慢性心力衰竭(CHF)中心室重塑的主要機制之一，為此抗細胞凋亡治療為防治CHF開辟了新天地〔1〕。心肌細胞凋亡受一系列凋亡基因調(diào)控，其中bax、bcl-2凋亡相關(guān)基因在凋亡程序中作用尤為重要〔2〕。目前血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)是治療CHF的基礎(chǔ)性藥物，其中雷米普利是療效較肯定的ACEI類藥物之一〔3〕。曲美他嗪(TMZ)是一種具有調(diào)控心肌細胞能量代謝的藥物，臨床上治療冠心病心力衰竭也已較為廣泛〔4〕，其療效是否與ACEI相似及聯(lián)合用藥療效如何值得探討。本研究觀察曲美他嗪與雷米普利單用及聯(lián)合用藥治療CHF的療效，以及bax、bcl-2表達水平的變化。

1　材料與方法

1.1CHF大鼠模型的復(fù)制及分組雄性Wistar大鼠50只，體重200～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證編號：2009-0004。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機抽取10只作為假手術(shù)組，其余大鼠全部采用腎上腹主動脈縮窄手術(shù)制作CHF模型〔2〕。假手術(shù)組動物只分離腹主動脈，不結(jié)扎。術(shù)后給予腹腔青霉素20萬單位連續(xù)注射3 d。常規(guī)喂養(yǎng)4 w后，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，脫毛，活動較少、食欲減退等表現(xiàn)，檢測血流動力學參數(shù)：左室舒張末壓(LVEDP)≥15 mmHg，提示造模成功。曲美他嗪組給予曲美他嗪10 mg·kg-1·d-1，雷米普利組給予雷米普利1 mg·kg-1·d-1，聯(lián)合用藥組給曲美他嗪10 mg·kg-1·d-1和雷米普利1 mg·kg-1·d-1，給予假手術(shù)組及模型組等量生理鹽水灌胃，連續(xù)4 w〔5〕。

1.2方法

1.2.1血流動力學監(jiān)測大鼠觀察終止時測其體重，監(jiān)測血流動力學后開胸取心臟，冰生理鹽水清洗，測其重量，后取左心室測重后，測心臟重量指數(shù)(HWI)和左心室重量指數(shù)(LVMI)。一部分左心室4%多聚甲醛固定留待石蠟包埋做免疫組化，一部分液氮保存做RT-PCR。

1.2.2心肌凋亡指數(shù)(AI)檢測用原位缺口末端標記法(TUNEL)，試劑盒購自美國羅氏(Roche)公司，按試劑盒說明操作，以細胞核被染成棕褐色為陽性結(jié)果。每個標本隨機觀察6個高倍視野(×200)計算陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，取平均值，AI=凋亡細胞核數(shù)/總細胞核數(shù)×100%。

1.2.3免疫組化法檢測bax、bcl-2蛋白嚴格按照免疫組織化學試劑盒(SP法)操作，SP試劑盒購自北京四正柏生物有限公司，兔抗鼠多克隆抗體bax、bcl-2購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，一抗工作濃度均為1∶100，以PBS代替一抗作為陰性對照。bax、bcl-2陽性效應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要分布于細胞質(zhì)。采用WiVnt圖像分析系統(tǒng)在×200倍鏡下對bax、bcl-2陽性結(jié)果進行半定量分析。每個標本隨機觀察6個視野，以陽性產(chǎn)物面積/視野面積表示該抗原的相對含量，并取其平均值。

1.2.4RT-PCR檢測心肌組織bax、bcl-2 mRNA的表達按 Trizol(美國Invitrogen公司)說明書提取組織總 RNA，測定 RNA濃度和純度。bax引物序列：上游5′- TTTCATCCAGGATCGAGCAG -3′，下游5′- CAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC -3＇(擴增片段為263 bp);bcl-2引物序列：上游5′- GACGAGAAGTGCTATTGGT -3′，下游5′- TCAGGCTGGAAGGAGAAGAT -3＇(擴增片段為205 bp)，β-actin引物序列：上游5′-GAGAGGGAAATCGTGCG -3′，下游:5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA -3′(擴增片段為452 bp)。以上引物均由上海生工生物公司合成，RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。擴增條件:取2 μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：30℃，10 min;55℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min。PCR反應(yīng)條件為：94℃，2 min;94℃，30 s;52℃～57℃，30 s;72℃，1 min，第二步起30個循環(huán)。退火溫度分別為55℃，57℃，57℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 mg/L Goldview)，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像， 采用Quantity One-v4.6.2軟件進行定量分析，觀測各條帶的灰度值，并計算目的條帶與相應(yīng)β-actin條帶灰度的比值。

2　結(jié)　果

2.1血流動力學參數(shù)與假手術(shù)組比較，模型組LVEDP顯著升高(P<0.01)，±dp/dtmax明顯降低(P<0.01)，與模型組相比，曲美他嗪組、雷米普利組和聯(lián)合用藥組LVEDP明顯下降(P<0.01)，±dp/dtmax顯著升高，聯(lián)合用藥組變化最明顯(P<0.01)，見表1。

表1　各組大鼠血流動力學指標、心臟指數(shù)及AI比較±s,n=10)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與曲美他嗪組比較：3)P<0.01;與雷米普利組比較： 4)P<0.01，下表同

2.2HWI及LVMI與假手術(shù)組比較，模型組大鼠HWI、LVMI顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，曲美他嗪組、雷米普利組和聯(lián)合用藥組HWI 、LVMI明顯下降(P<0.01)，聯(lián)合用藥組變化最明顯(P<0.01)，見表1。

2.3心肌組織細胞AI假手術(shù)組僅有少量凋亡細胞，細胞核呈棕黃色；模型組較假手術(shù)組的凋亡細胞明顯增多(P<0.01)，曲美他嗪組、雷米普利組、聯(lián)合用藥組較模型組減少(P<0.01)，聯(lián)合用藥組減少最明顯(P<0.01)，見表1，圖1。

2.4免疫組化指標測定各組大鼠心肌細胞bax與bcl-2蛋白陽性表達為棕黃色顆粒，均位于細胞質(zhì)中。假手術(shù)組僅有少量bax表達，bcl-2明顯表達。模型組bax陽性表達明顯增多顏色明顯加深，其他3個用藥組表達有所減少，其中以聯(lián)合用藥組表達最少；bcl-2在模型組中表達極少，3個用藥組表達強度增加，聯(lián)合用藥組增加最顯著。見表2、圖2、圖3。

表2　各組大鼠心肌bax、bcl-2蛋白的表達

2.5RT-PCR法測定bax mRNA與bcl-2 mRNA的表達與假手術(shù)組比較，模型組baxm RNA表達水平明顯升高，bcl-2 mRNA表達水平明顯下降。與模型組比較，其他3個用藥組bax mRNA表達水平表達有所減少，其中以聯(lián)合用藥組減少最明顯，而3個用藥組中bcl-2 mRNA的表達水平明顯高于模型組，聯(lián)合用藥組升高最顯著。見圖4、圖5，表3。

圖1　各組大鼠心肌組織細胞凋亡(TUNEL,×200)

圖2　各組大鼠心肌組織細胞bax的表達(DAB，×200)

圖3　各組大鼠心肌組織細胞bcl-2的表達(DAB，×200)

M:Marker:1、6：假手術(shù)組;2、7：模型組;3、8：曲美他嗪組;4、9：雷米普利組;5、10：聯(lián)合用藥組圖4　各組大鼠心肌組織bax mRNA的表達

M:Marker:1、6：假手術(shù)組;2、7：模型組;3、8：曲美他嗪組;4、9：雷米普利組;5、10：聯(lián)合用藥組圖5　各組大鼠心肌組織bcl-2 mRNA的表達

組別baxmRNAbcl-2mRNAbcl-2/bax假手術(shù)組0.0433±0.00620.3768±0.00658.7021模型組0.2728±0.00661)0.0892±0.01861)0.327曲美他嗪組0.1667±0.00592)0.1487±0.01172)0.892雷米普利組0.1613±0.00512)0.1392±0.01392)0.863聯(lián)合用藥組0.1121±0.00862)3)4)0.1920±0.01242)3)4)1.7128

3　討　論

促凋亡蛋白bax和抗凋亡蛋白bcl-2 在各類凋亡信號介導(dǎo)的凋亡過程中起到關(guān)鍵作用〔6〕。Bcl-2蛋白位于細胞線粒體上可抑制線粒體外膜通透轉(zhuǎn)運孔(PT)孔道復(fù)合體的開放，減少細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的釋放，在核膜的外側(cè)可引起細胞核谷胱甘肽積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上可阻止胞內(nèi)可作為凋亡信號的Ca2+流動，近而抑制細胞凋亡〔7,8〕。Bax作為Bcl-2的同源體可抑制后者表達，增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫的加載，從而提高了鈣離子負載到凋亡效應(yīng)系統(tǒng)(包括線粒體)的水平，增加了鈣離子在生理和(或)病理過程中的暴露，近而促進凋亡〔9〕。

曲美他嗪是一種哌嗪類衍生物，可通過抑制3-酮酰基輔酶A硫解酶(3-KAT)，使心肌能量代謝從脂肪酸氧化轉(zhuǎn)移到葡萄糖氧化，從而改善缺血心肌的能量代謝，近而改善心肌的收縮功能〔10〕;另外可以促進游離脂肪酸合成磷脂，選擇性抑制線粒體酶，穩(wěn)定心肌細胞膜，維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，使心肌細胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生減少，減少心肌細胞的損傷及凋亡及由此引發(fā)的心室肌重構(gòu)和心功能的減退〔11,12〕。雷米普利屬于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)通過抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)介導(dǎo)的凋亡基因表達，減少細胞凋亡，逆轉(zhuǎn)心室重塑〔3,13〕。

本研究結(jié)果表明在傳統(tǒng)CHF治療基礎(chǔ)上給予改善心肌能量代謝的藥物，更能有效地保護心功能，抑制心肌細胞凋亡。曲美他嗪與雷米普利聯(lián)合用藥抗心肌凋亡作用優(yōu)于兩者單獨用藥，其分子機制可能與上調(diào)bcl-2、下調(diào)bax ，維持bcl-2/bax比值的穩(wěn)定密切相關(guān)。

1徐濤，郭麗峰，李方江，等.芪藶強心膠囊對H2O2誘導(dǎo)的H9C2大鼠心肌細胞凋亡的影響〔J〕.疑難病雜志,2010;9(5):325-7.

2沈啟明，馬麗紅，王少霞，等.心復(fù)力顆粒對阿霉素致擴張心肌病心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013;33(6)：783-8.

3James JD,Carl JL,James HO.Not all angiotensin-converting enzyme inhibitors are equal:focus on ramipril and perindopril〔J〕.Postgraduate Med,2013;125(4):154-68.

4徐艷秋.曲美他嗪對老年冠心病心力衰竭患者左室功能的影響觀察〔J〕.四川醫(yī)學,2013;34(7):1064-6.

5彭玉娟，謝亞芹，康大偉，等.曲美他嗪與雷米普利對慢性心力衰竭大鼠心肌組織轉(zhuǎn)化生長因子β1表達的影響〔J〕.中華老年心腦血管病雜志,2014;16(1):21-4.

6史婷婷，白建平，梁月琴，等.芹菜素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響〔J〕.中國藥理學通報,2011;27(5):666-71.

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9De Giusti VC,Caldiz CI,Ennis IL,etal.Mitochondrial reactive oxygen species(ROS)as signaling molecules of intracellular pathways triggered by the cardiac renin-angiotensin Ⅱ-aldosterone system(RAAS)〔J〕.Front Physiol,2013;126(4):1-9.

10郭行雷.曲美他嗪對老年慢性心力衰竭患者心率變異性影響的研究〔J〕.重慶醫(yī)學,2013;40(30):4044-5.

11楊勝利，何作云，劉惠亮，等.曲美他嗪對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)人心肌細胞凋亡的影響〔J〕.中國藥理學通報,2006;22(9):1061-6.

12厲潔.曲美他嗪調(diào)控氧化應(yīng)激大鼠慢性心力衰竭作用機制研究〔J〕.醫(yī)藥導(dǎo)報,2011;30(2):183-6.

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〔2014-12-30修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

李秀華(1967-)，女，主任醫(yī)師，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事慢性心力衰竭臨床及病理生理研究。

馮翔宇(1987-)，女，在讀碩士，主要從事慢性心力衰竭臨床及病理生理研究。

R541.6

A

1005-9202(2016)15-3626-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.007