抵抗素對(duì)HepG2肝細(xì)胞胰島素信號(hào)通路IRS-2/Akt的影響

羅招凡　李芳萍　程　樺

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東　廣州　510120)

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抵抗素對(duì)HepG2肝細(xì)胞胰島素信號(hào)通路IRS-2/Akt的影響

羅招凡李芳萍1程樺1

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510120)

目的探討抵抗素對(duì)HepG2肝細(xì)胞中胰島素信號(hào)通路IRS-2/Akt的影響及其與腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路之間的關(guān)系。方法50 ng/ml重組人抵抗素處理肝HepG2細(xì)胞株，siRNA技術(shù)抑制HepG2細(xì)胞AMPK α2亞基表達(dá)，采用實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)胰島素信號(hào)通路相關(guān)細(xì)胞信號(hào)抑制因子3(SOCS-3)和胰島素受體底物2(IRS-2)mRNA的水平，采用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)蛋白激酶B(Akt)的蛋白含量及磷酸化水平。結(jié)果在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下，抵抗素上調(diào)SOCS-3 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，下調(diào)IRS-2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，僅在胰島素刺激狀態(tài)下降低Akt總蛋白含量及其磷酸化水平(P<0.05)，且未轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染AMPKα2 siRNA組比較，Akt總蛋白含量及其磷酸化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路IRS-2/Akt起抑制作用，這可能是其導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗的機(jī)制之一；抵抗素對(duì)IRS-2/Akt信號(hào)通路與AMPK通路的影響可以相互獨(dú)立。

抵抗素；胰島素抵抗；蛋白激酶B；HepG2細(xì)胞

抵抗素(Resistin)是一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，屬于抵抗素樣分子(RELMs)，又稱FIZZs(found in inflammatory zone)家族成員，在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中它是一種脂肪分泌因子〔1〕，曾被認(rèn)為是聯(lián)系肥胖和糖尿病之間的紐帶〔2〕。體試驗(yàn)表明，輸注抵抗素后能極顯著增加肝糖輸出及損傷肝臟胰島素作用，其主要機(jī)制是通過(guò)抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化上調(diào)肝糖異生關(guān)鍵酶G6Pase、PEPCK的表達(dá)。然而，抵抗素在人類(lèi)的病理作用還存在爭(zhēng)議〔3，4〕，因?yàn)槿说挚顾赝∈蟮牡挚顾卦诎被崴缴现挥?9%的同源性，而且其來(lái)源也不盡相同，人抵抗素主要來(lái)源于單核細(xì)胞。肝臟胰島素抵抗(IR)被認(rèn)為是導(dǎo)致2型糖尿病(T2DM)的重要原因〔5〕。其分子機(jī)制是胰島素信號(hào)通路異常改變〔6〕。胰島素信號(hào)通路包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路，其中PI3K/蛋白激酶B(Akt)通路是主要的胰島素信號(hào)通路，調(diào)節(jié)著體內(nèi)的糖脂代謝。基于此，本課題擬研究人抵抗素是否對(duì)HepG2肝細(xì)胞PI3K/Akt通路產(chǎn)生影響，并探討其與AMPK通路之間的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料及主要試劑抵抗素 (美國(guó)Phoenix.Inc)；胰島素(Humulin，40 IU/ml)(Lily公司)；AMPK α2 siRNA及CY3熒光標(biāo)記對(duì)照siRNA、siPORTNeoFX轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Ambion公司)；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清 (美國(guó)Gibco公司)；兔抗磷酸化AMPK α(Thr172)抗體、Akt及磷酸化Akt(Ser473)(美國(guó)Cell Signaling公司)；SYBR GreenⅠPCR 通用混合試劑(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù)人肝HepG2細(xì)胞株來(lái)源于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按1×105個(gè)/孔的密度接種細(xì)胞于培養(yǎng)板，經(jīng)AMPK α2 siRNA(res50+ siRNA group)、陰性對(duì)照siRNA(res50+ con siRNA group)轉(zhuǎn)染24 h的HepG2細(xì)胞用含50 ng/ml抵抗素的低糖DMEM培養(yǎng)液處理24 h，同時(shí)未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞在相同條件下用無(wú)(res0 group)或50 ng/ml抵抗素(res50 group)處理24 h，之后用去血清的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液(仍含對(duì)應(yīng)濃度的抵抗素)饑餓3～5 h，最后用無(wú)或含100 nmol/L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液處理2 h后收集細(xì)胞。

1.2.2siRNA序列合成及轉(zhuǎn)染根據(jù)GenBank AMPK α2基因已知序列(Accession No.NM-006252)，已確證的AMPK α2 siRNA(Silencer?Validated siRNA)由Ambion公司提供，AMPK α2 siRNA正義鏈：5′-GGUUUCUUAAAAACAGCUGtt-3′，并采用CY3熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA(siRNA control) 監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率，用轉(zhuǎn)染試劑處理組作為空轉(zhuǎn)對(duì)照組(mock組)。

1.2.3RNA的提取及實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)mRNA水平用TRIZOL分離提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃變性10 min，然后95℃15 s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。在PCR反應(yīng)結(jié)束后采用溶解曲線方法驗(yàn)證反應(yīng)的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以管家基因18 sRNA的循環(huán)閾值(Ct)作標(biāo)準(zhǔn)化，稱為ΔCt，最終各基因的表達(dá)結(jié)果為2-ΔΔCT，其中-ΔΔCT 等于處理組ΔCt減去對(duì)照組ΔCT，對(duì)照組2-ΔΔCT值為1。各基因引物用Primer Express2.0軟件設(shè)計(jì)，其特異性及有效性在實(shí)驗(yàn)前均被證實(shí)。各正義及反義引物序列見(jiàn)表1。

表1　實(shí)時(shí)定量PCR引物

1.2.4Western印跡檢測(cè)總Akt、AMPK及Akt磷酸化蛋白表達(dá)收集6孔板細(xì)胞，加200 μl的裂解液，按Western印跡操作流程進(jìn)行檢測(cè)，用Image-Quant分析軟件測(cè)定結(jié)果中條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin 條帶灰度值的比值表示各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)　果

2.1AMPK α2 siRNA對(duì)AMPK α2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染24 h后，AMPK α2 mRNA表達(dá)抑制率為(52.3±0.8)%，轉(zhuǎn)染72 h后AMPK α2蛋白表達(dá)抑制率為(48.1±2.3)%。

2.2抵抗素在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響與res0組比較，在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下，抵抗素增加SOSC-3 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，降低IRS-2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)；單獨(dú)抵抗素處理組(res50 group)與轉(zhuǎn)染AMPK α2 siRNA的抵抗素處理組(res50+siRNA group)比較，IRS-2和SOSC-3 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2　抵抗素在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響±s)

與res0組比較：1)P<0.05；與基礎(chǔ)狀態(tài)下對(duì)應(yīng)組比較：2)P<0.05

2.3抵抗素在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下對(duì)HepG2細(xì)胞AMPK及Akt蛋白及磷酸化水平的影響與res0組比較，在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下抵抗素降低AMPK的磷酸化水平(P<0.05)，僅在胰島素刺激狀態(tài)下降低Akt總的蛋白含量及其磷酸化水平(P<0.05);單獨(dú)抵抗素處理組(res50 group)與轉(zhuǎn)染AMPK α2 siRNA的抵抗素處理組(res50+siRNA group)比較，Akt總蛋白含量及其磷酸化水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而AMPK的磷酸化水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表3。

表3　在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞AMPKα(Thr172)、Akt蛋白及Akt (Ser473)磷酸化水平的影響

與res0組比較：1)P<0.05，與res50組比較：2)P<0.05，與res50+control siRNA組比較：3)P<0.05；與基礎(chǔ)狀態(tài)下對(duì)應(yīng)組比較：4)P<0.05

圖1　抵抗素在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下對(duì)HepG2細(xì)胞AMPK磷酸化及Akt蛋白總量及磷酸化水平的影響

3　討　論

絲/蘇氨酸激酶(Akt)主要負(fù)責(zé)由PI3K始動(dòng)的生物信息的傳導(dǎo)，Akt處于這一通路的中心環(huán)節(jié)，它在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與IR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。以往對(duì)抵抗素的研究發(fā)現(xiàn)，抵抗素可能通過(guò)抑制PI3K/Akt通路導(dǎo)致IR〔7〕，另也有報(bào)道胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑的Akt并不受抵抗素的影響〔8〕，因此各家報(bào)道并不一致。本研究主要觀察抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素IRS-2/PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人抵抗素在胰島素刺激條件下可下調(diào)IRS-2 mRNA的表達(dá)、減低Akt的蛋白量及其磷酸化水平，抵抗素這一抑制作用可能與其導(dǎo)致肝臟IR的機(jī)制有關(guān)。

SOCS家族是近年發(fā)現(xiàn)含有肉瘤同源區(qū)段2(SH2)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族，現(xiàn)共發(fā)現(xiàn)8個(gè)SOCS家族成員(CIS，SOCS-1～SOCS-7)，廣泛分布于胸腺、腦、心臟、骨骼肌、肝臟等組織器官，其中SOCS-3主要參與負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子及一些激素誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。2005年Steppan等〔9〕首先發(fā)現(xiàn)抵抗素可誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞SOCS-3表達(dá)增加，而后者可與胰島素受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。隨后Zhou等〔7〕也報(bào)道人抵抗素可刺激L-02肝細(xì)胞SOCS-3 mRNA的表達(dá)而阻止胰島素信號(hào)通路，Qi等〔10〕則報(bào)道抵抗素基因敲除鼠SOCS-3水平降低，導(dǎo)致肌肉Akt磷酸化水平上升，使胰島素敏感性增強(qiáng)。

IRS-2是胰島素受體信號(hào)耦聯(lián)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，胰島素與受體結(jié)合后，激活I(lǐng)RS分子，募集含SH2結(jié)構(gòu)域的多種分子并與它們結(jié)合，通過(guò)這些分子向多個(gè)方向進(jìn)一步傳遞胰島素信號(hào)。細(xì)胞IRS表達(dá)水平的高低是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)正常與否的基礎(chǔ)，當(dāng)IRS的濃度下降到一定程度，胰島素信號(hào)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)就會(huì)受到阻滯。資料表明，肝細(xì)胞中IRS-2在維持糖代謝平衡及IRS-2缺陷對(duì)T2DM發(fā)生發(fā)展比IRS-1更重要〔11〕。

本實(shí)驗(yàn)表明，HepG2細(xì)胞與人抵抗素慢性孵育24 h后，在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下，人抵抗素作為細(xì)胞因子可上調(diào)HepG2細(xì)胞SOSC-3 mRNA的表達(dá)、下調(diào)IRS-2 mRNA的表達(dá)，僅在胰島素刺激狀態(tài)下減低Akt總蛋白含量及其Ser473磷酸化水平。推測(cè)抵抗素使表達(dá)上調(diào)的SOCS-3的SH2結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合胰島素受體，抑制了IRS-2的表達(dá)，而IRS-2的下調(diào)可使胰島素信號(hào)傳導(dǎo)減弱，導(dǎo)致了胰島素生物效應(yīng)降低，從而誘發(fā)肝細(xì)胞IR。以上結(jié)果與Zhou等〔12〕報(bào)道結(jié)果相似。

目前對(duì)AMPK通路與Akt通路之間的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議。在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，AMPK可以增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)以及GLUT-4的轉(zhuǎn)位，該作用與胰島素信號(hào)通路不盡相同，研究提示AMPK可能是通過(guò)遠(yuǎn)離Akt作用位點(diǎn)的胰島素信號(hào)通路，或者是一條非胰島素激活的信號(hào)通路〔13〕。但另有研究表明，在C2C12肌細(xì)胞中AMPK可使胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑的上游組分IRS-1磷酸化，表明AMPK是胰島素信號(hào)通路上游潛在的調(diào)節(jié)子〔14〕。出現(xiàn)以上不同的結(jié)果可能是由于研究細(xì)胞特性不同、所處環(huán)境不同、采用的實(shí)驗(yàn)條件及方法不同等。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在胰島素刺激狀態(tài)下，HepG2細(xì)胞單獨(dú)抵抗素組與AMPK α2 siRNA轉(zhuǎn)染后的抵抗素處理組SOSC-3和IRS-2 mRNA的表達(dá)、Akt的蛋白量及其磷酸化水平并無(wú)顯著差異，說(shuō)明人抵抗素可以影響HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路，但這一影響并不依賴于AMPK。以上結(jié)果提示，人抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞AMPK通路與胰島素PI3K/Akt通路的影響可以相互獨(dú)立，但兩條通路之間的關(guān)系極為復(fù)雜，有待進(jìn)一步探討。

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14Jakobsen SN，Hardie DG，Morrice N，etal.5'-AMP-activated protein kinase phosphorylatesIRS-1 on Ser-789 in mouse C2C12 myotubes in response to 5-aminoimidazole-4-carboxamideriboside〔J〕.J Biol Chem,2001；276(50)：46912-6.

〔2015-12-03修回〕

(編輯李相軍)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30570886)；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(教外司留〔2015〕1098號(hào))

羅招凡(1972-)，女，醫(yī)學(xué)博士，副主任技師，主要從事代謝綜合征與腫瘤的基礎(chǔ)研究。

R589

A

1005-9202(2016)15-3629-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.008

1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院內(nèi)分泌科