MUC3A在肝外膽管癌組織中的表達及臨床意義

周海斌，金杭斌，謝璐，張筱鳳，楊建鋒

MUC3A在肝外膽管癌組織中的表達及臨床意義

周海斌，金杭斌，謝璐，張筱鳳，楊建鋒

目的探討黏蛋白3A（MUC3A）在肝外膽管癌（ECC）組織中的表達及其臨床意義。方法收集手術切除的ECC癌組織標本35份（35例），以手術切緣陰性組織為正常組織標本20份（20例）。采用鏈霉素親和生物素-過氧化物酶免疫組化方法（SP法）檢測并對比MUC3A在膽管癌組織和正常膽管組織中的表達情況，同時收集35 例ECC患者的臨床病理資料，分析MUC3A與臨床病理特性之間的相關性。結果MUC3A在腫瘤組織癌巢中高表達，在腫瘤細胞的胞漿中顯示出高信號，同時癌巢中的管腔內也可見到不同程度的免疫染色。MUC3A在ECC癌組織中的陽性表達率為85.7％，在正常膽管組織中的陽性表達率為35.0％，兩者差異有統計學意義（＜0.01）。膽管癌組織中MUC3A的表達與性別、年齡、腫瘤部位方面均無關（均＞0.05）；MUC3A在癌組織低分化或未分化、有淋巴結轉移、有周圍組織浸潤、UICC分期Ⅲ～Ⅳ期中的陽性表達率均高于癌組織的中分化或高分化、無淋巴結轉移、無周圍組織浸潤、UICC分期Ⅰ～Ⅱ期（均＜0.05）。結論MUC3A在膽管癌組織中高表達，并與病理類型、淋巴結轉移、腫瘤分期密切相關，MUC3A蛋白高表達提示ECC患者預后不良。

膽管腫瘤；肝外膽管癌；黏蛋白3A；臨床病理；預后

膽管癌統指膽管系統襯覆上皮發生的一種惡性程度很高的腫瘤，按所發生的部位可分為肝內膽管癌和肝外膽管癌（ECC）兩大類［1］。ECC對化療、放療等輔助性治療普遍不敏感，手術切除腫瘤組織是唯一有效的治療手段，然而，臨床上超過2/3以上的患者明確診斷時已屬于晚期而失去了手術根治的機會［1-2］。對于無法手術切除病灶的患者，其生存期通常只有6～9個月［3-4］。由此，尋找探索ECC發病以及惡化進展的相關因素及分子機制，對改善ECC患者預后及總體生存率具有重要意義。筆者前期通過抽取ECC患者膽汁進行差異蛋白質組學研究發現在ECC患者與正常人群膽汁中MUC3A表達具有明顯的差異。為了更深入認識MUC3A與ECC之間的關系，筆者應用免疫組織化學方法檢測在膽管癌組織中的表達情況，并分析與ECC臨床病理特性的關系，現將結果報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2012年1月至2014 年12月杭州市第一人民醫院手術切除的ECC癌組織石蠟標本35份（35例患者），術前均未接受化療或放療等抗腫瘤治療。其中男16例，女19例；年齡36～70歲，平均（52.6±8.9）歲。選擇其中經病理學證實未發現腫瘤細胞浸潤的陰性切緣標本作為正常膽管組織（20份，來自20例患者），其中男11例，女9例；年齡40～69歲，平均（58.5±9.5）歲。兩組性別、年齡差異均無統計學意義（均＞0.05）。

1.2研究方法采用免疫組化方法檢測MUC3A在組織中的表達。（1）采用鏈霉素親和生物素-過氧化物酶免疫組化方法（SP法）進行免疫組化染色，按照SP免疫組化試劑盒說明書所要求的步驟進行操作；采用雙盲法、由兩名高年資病理專業醫師獨立閱片，以已知陽性切片作陽性對照片，用PBS代替一抗作陰性對照。（2）主要實驗試劑：MUC3A采用小鼠抗MUC3A抗體（LifeSpan Biosciences，美國）。（3）實驗結果判斷：采用半定量方法，依據陽性染色強度和陽性細胞所占百分比兩個方面。其中染色強度評分標準為：細胞無著色記0分、細胞著色為淺黃色記1分、細胞著色為棕黃色記2分、細胞著色為棕褐色記3分；陽性細胞百分比評分標準為：細胞全部陰性記0分、陽性細胞比率＜10％記1分、陽性細胞比率為11％～50％記2分、陽性細胞比率為51％～75％記3分、陽性細胞比率＞75％記4分；然后將細胞染色強度的分值乘以陽性細胞比率的分值，依據所得數值的不同將免疫組化結果分為4個等級：0～2分記為―、3～4分記為+、6～8分記為2+、9～12分記為3+，其中0～2分定為陰性表達、3 ～12分定為陽性表達。

1.3統計方法采用SPSS 16.0統計軟件包對實驗數據進行統計學分析，率的比較采用2檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1MUC3A在膽管癌組織和正常膽管組織中的表達MUC3A在腫瘤組織癌巢中高表達，在腫瘤細胞的胞漿中顯示出高信號，同時癌巢中的管腔內也可見到不同程度的免疫染色。MUC3A在ECC癌組織中的陽性表達率為85.7％，在正常膽管組織中的陽性表達率為35.0％，兩者差異有統計學意義（2=14.87，＜0.01），見表1。

2.2ECC患者臨床病理特征腫瘤位于肝門部13例、遠端22例，分別占37.1％、62.9％；病理類型均為腺癌，其中高分化和中分化18例，低分化和未分化17例，分別占51.4％、48.6％；發生淋巴結轉移者25例、無淋巴結轉移者10例，分別占71.4％、28.6％；侵及周圍組織器官者23例、未侵及周圍組織器官12例，分別占65.7％、34.3％；UICC分期I～II期9例、III～Ⅳ期26例，分別占25.7％、74.3％。

2.3MUC3A的表達與膽管癌臨床病理特征的關系以年齡60歲、腫瘤位于肝門或遠端、組織分化程度是中分化和高分化或低分化和未分化、有或無淋巴結、有或無周圍組織浸潤、國際抗癌協會制定的膽管癌臨床病理分期標準（即UICC分期）Ⅰ～Ⅱ或Ⅲ～Ⅳ為標準。膽管癌組織中MUC3A的表達與性別、年齡、腫瘤部位方面均無關（均＞0.05）；MUC3A在癌組織低分化或未分化、有淋巴結轉移、有周圍組織浸潤、UICC分期Ⅲ～Ⅳ期中的陽性表達率均高于癌組織的中分化或高分化、無淋巴結轉移、無周圍組織浸潤、UICC分期Ⅰ～Ⅱ期（均＜0.05），見表2。

3　討論

目前臨床上對ECC的診斷主要依據“無痛性黃疸+膽管擴張+膽管腫物”的診斷模式，ECC早期診斷率不高，加上ECC惡性程度高，進展快，因此，超過2/3以上的患者明確診斷時已屬腫瘤晚期［1-2］。本研究納入的術前判斷可行手術根治切除的35例患者中，術后發現有淋巴結轉移、周圍組織浸潤、UICC分期Ⅲ～Ⅳ期分別高達到71.4％、65.7％、74.3％。因此，除提高早期診斷率外，有必要深入進行ECC惡化進展的相關因素及分子機制研究，為進一步提高臨床治療效果提供思路。

大量研究顯示黏蛋白是許多惡性腫瘤的有效且可靠的預后判斷指標，MUC3是黏蛋白的一種，位于染色體7q22上的黏蛋白簇，歸類為膜相關黏蛋白，分為MUC3A和MUC3B兩個亞型［5］，以往MUC3A的研究多集中與胃腸道腫瘤，發現MUC3A的表達與胃癌、結腸癌的浸潤深度、淋巴結轉移和腫瘤分期密切相關［6-7］。Shibahara等［8］通過免疫組化檢測闌尾腺癌組織MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC6、MUC16和MUC17的表達，多元分析顯示靜脈浸潤陽性、非治愈性切除和MUC3表達陽性是闌尾腺癌預后不佳的獨立危險因素。

表1　MUC3A在膽管癌組織和正常膽管組織的表達例

表2　MUC3A表達與膽管癌臨床病理特征的關系例

有關MUC3A在肝膽管正常組織及膽管癌中表達的研究數量不多，且大多為國外研究。有研究顯示肝膽管上皮細胞在出生之前主要表達MUC1，出生之后停止表達而轉變為MUC3表達［9］。Sasaki等［10］報道在正常膽囊及肝內膽管組織黏蛋白基因主要表達MUC3；MUC3A在與肝硬化相關或合并肝細胞肝癌的膽管癌患者中表達是降低的［11］；并通過分析19例肝門部和10例遠端膽管癌發現，MUC3A的表達與腫瘤部位具有相關性，肝門部陽性率（68％）明顯高于遠端膽管癌（10％）［12］。但本研究結果未顯示肝門部與遠端膽管在MUC3A陽性率上的差異，推測MUC3A表達與腫瘤部位不具有相關性，這可能與納入研究的人群、病理類型、分化程度及腫瘤分期等因素不同有關。

本研究結果顯示MUC3A在ECC腫瘤組織癌巢中高表達，其陽性率明顯高于癌旁正常組織，MUC3A在腫瘤細胞的胞漿中顯示出高信號，同時癌巢中的管腔內也可見到不同程度的免疫染色，提示MUC3A可以被腫瘤細胞分泌至細胞外。MUC3A的陽性表達比例在腫瘤細胞分化低、有淋巴結轉移、周圍浸潤和UICC分期在III～IV患者中明顯升高，提示MUC3A與ECC病理類型、腫瘤分期密切相關，MUC3A的陽性表達可影響著ECC患者的預后，是預后不良的因素之一。

ECC組織學類型以腺癌最常見，本組35例患者均為腺癌。根據癌細胞分化程度將膽管癌劃分為4個病理類型：高分化型、中分化、低分化及未分化型，不同組織學類型的膽管癌其發生機制和生物學行為有所不同。因樣本量有限，本研究根據病理與預后的關系，將低分化及未分化型合并一組，中分化和高分化合并為一組，結果顯示低分化及未分化組MUC3A陽性率明顯高于中分化和高分化一組，提示MUC3A表達與ECC腫瘤細胞分化程度密切相關，MUC3A陽性率越高，腫瘤細胞分化程度越低，預后越差。與本研究結果不同，Mall等［13］通過對26例膽管癌組織標本進行黏蛋白免疫組化發現，僅6例（23.1％）患者MUC3呈強陽性表達，且MUC3在組織高分化中陽性表達率要明顯高于低分化和中分化，這也可能與納入研究的人群、腫瘤分期等因素不同有關。

手術切除是治療膽管癌的首要方法，手術效果主要取決于腫瘤的部位和腫瘤浸潤膽管的程度、手術無瘤切緣及是否有淋巴轉移。UICC分期對于ECC治療及預后判斷具有重要的指導意義。本研究中將Ⅰ、Ⅱ期合并為一組，Ⅲ期和Ⅳ期合并為一組，Ⅲ期和Ⅳ期組MUC3A陽性表達率明顯高于Ⅰ和Ⅱ期組，提示MUC3A陽性率與腫瘤分期密切相關，腫瘤分期越遲，MUC3A陽性表達率越高，提示預后越差。

綜上所述，MUC3A在ECC腫瘤組織內高表達，并且該蛋白的表達狀態與病理類型、腫瘤分期具有密切的相關性，MUC3A蛋白高表達預示著ECC患者不良的預后。筆者下一步將通過研究MUC3A對膽管癌細胞的生長、克隆增殖及細胞周期的影響，進一步探討其在膽管癌發生和演進過程中的作用及可能分子機制。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.08.033

R735.8

A

1671-0800（2016）08-1040-03

2016-05-04

（本文編輯：姜曉慶）

浙江省科技計劃項目（2015C33251）；浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2013KYB204）

310005杭州，浙江中醫藥大學附屬杭州醫院

楊建鋒，Email：yjf-1976@163.com