健脾安腸丸對(duì)D-IBS大鼠模型血漿VIP、P物質(zhì)水平的影響

宋亞璐,張夢(mèng)宇,楊瑩,王欣,荀麗英,孫明江

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，a.藥學(xué)院，b.實(shí)驗(yàn)中心，c.藥理教研室，山東 濟(jì)南　250355)

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◇藥學(xué)研究◇

健脾安腸丸對(duì)D-IBS大鼠模型血漿VIP、P物質(zhì)水平的影響

宋亞璐a,張夢(mèng)宇a,楊瑩b,王欣c,荀麗英c,孫明江c

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，a.藥學(xué)院，b.實(shí)驗(yàn)中心，c.藥理教研室，山東 濟(jì)南250355)

目的研究健脾安腸丸對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠血管活性腸肽VIP、P物質(zhì)水平的影響。方法采用束縛-大黃灌胃致大鼠肝郁脾虛模型，觀察健脾安腸丸對(duì)血漿VIP、P物質(zhì)水平的影響。結(jié)果(1)與正常組相比，模型組VIP、SP水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)；(2)與模型組相比，大中小劑量組VIP、SP水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論健脾安腸丸能夠顯著降低D-IBS大鼠模型血漿SP、VIP水平，顯著改腹瀉的癥狀。

健脾安腸丸；腸易激綜合征；肝郁脾虛模型；腦腸軸；水通道蛋白

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome ,IBS)是一種臨床上常見的功能性胃腸疾病，可分為腹瀉型D-IBS、便秘型C-IBS、混合型M-IBS及未分化型U-IBS[1]，是一種多因素引起的胃腸功能性紊亂疾病。中醫(yī)理論認(rèn)為腸易激綜合征的發(fā)病機(jī)制在于脾虛濕盛，肝失疏泄，而基于這一理論配伍的健脾安腸丸是由黨參、白術(shù)、葛根、薏苡仁、白芍、木香、防風(fēng)、烏梅、陳皮、芡實(shí)等組成的，具有疏肝理氣，健脾利濕，能夠顯著改善D-IBS患者腹痛、腹瀉等各種臨床不適癥狀的作用。筆者為探究健脾安腸丸對(duì)腹瀉型腸易激綜合征的治療作用，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。

1　材料與方法

1.1藥物健脾安腸丸自制，用法用量：每日3次，每次10 g。由濟(jì)南市中醫(yī)院提供，健脾安腸丸加水溶解配制成0.268 kg·L-1備用。陽性藥物匹維溴銨片，規(guī)格：50 mg×15片/盒，批號(hào)：635374，用法用量：每日3次，每次50 mg，Abbott Healthcare SAS(法國)，研缽研成粉末加水配制成濃度為0.1339%溶液備用。大黃：山東嘉泰中藥飲片有限公司，批號(hào)：131002。(計(jì)算公式:X大鼠日灌胃量=6.25×0.25×成人日服藥量/70，成人平均體質(zhì)量按70 kg，大鼠平均體重0.25 kg計(jì)算)

1.2儀器Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)；JA500N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；紫外可見光分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品)。

1.3動(dòng)物Wistar大鼠，SPF級(jí)，雌性，72只，體重200～300 g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)20130001。

1.4試劑本實(shí)驗(yàn)所用兩個(gè)試劑盒均采用酶聯(lián)免疫分析，雙抗體夾心法測定。所用試劑盒為VIP、P物質(zhì)ELISA試劑盒，購自上海百蕊生物科技有限公司。

1.5方法

1.5.1分組

72只雌性大鼠按體質(zhì)量分為正常對(duì)照組12只、模型組15只、陽性組15只、健脾安腸丸大劑量組10只(5.36 g·kg-1相當(dāng)于臨床等效量2倍)、中劑量組10只(2.68 g·kg-1,相當(dāng)于臨床等效量1倍)、小劑量組10只(1.34 g·kg-1，相當(dāng)于臨床等效量1/2倍)。

1.5.2造模

大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3 d，參考唐洪梅等[2]的造模方法采取束縛+大黃灌胃造模。評(píng)價(jià)指標(biāo)參考杜立東等[3]的文獻(xiàn)，選擇大鼠一般狀況、體重、稀便、血漿SP、VIP含量等。大黃煎煮液的配置：根據(jù)大鼠的數(shù)量和造模的時(shí)間需要取800 g大黃加水1 000 mL浸泡3 h，煎煮8 min，濾去藥渣，定容至1 000 mL。給予除正常組外各組大黃灌胃0.5 mL·100 g-1，每天下午兩點(diǎn)使用束縛箱準(zhǔn)時(shí)進(jìn)行束縛，時(shí)間為1 h，連續(xù)10 d。正常對(duì)照組給予生理鹽水灌胃0.5 mL·100 g-1。

1.5.3給藥

造模成功后開始用藥，正常對(duì)照組及模型組給以生理鹽水灌胃0.5 mL·100 g-1；大劑量組給藥0.268 kg·L-1×5 mL，中劑量組給藥0.268 kg·L-1×2.5 mL，小劑量組給藥0.134 kg·L-1×2.5 mL；陽性組給以濃度0.133 9%匹維溴銨溶液2.5 mL。每天早晨八點(diǎn)灌胃，連續(xù)灌服兩周。

1.5.4VIP、P物質(zhì)的測定

樣本采集：末次給藥1 h后，1%戊巴比妥鈉麻醉，無動(dòng)眼反射后固定，腹主靜脈取血5 mL，置于用肝素潤洗的EP管中，混勻后離心，取上清液；試劑盒檢測：大鼠血管活性腸肽(VIP)或P物質(zhì)(SP)酶聯(lián)免疫分析步驟：標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋→加樣→溫育→配液→洗滌→加酶→溫育→洗滌→顯色→終止→測定。

1.5.5觀察指標(biāo)

大、中、小劑量組和模型組自給藥當(dāng)日起，每日統(tǒng)計(jì)大鼠稀便數(shù)、糞便總數(shù)，并計(jì)算稀便占總糞便數(shù)的百分率。

2　結(jié)果

2.1健脾安腸丸對(duì)肝郁脾虛模型大鼠一般狀況的影響大鼠在建模后，逐漸出現(xiàn)脫毛、皮毛無光澤、嗜睡、大便稀溏的現(xiàn)象，由表1可知，造模結(jié)束后模型組稀便率達(dá)99.00%，大中小劑量組也均在90.00%以上，說明達(dá)到了預(yù)期造模效果。治療末，健脾安腸丸各組大鼠稀便明顯減少，稀便率正常組0.94%、模型組95.33%、陽性組59.17%。與造模后比較，治療末大中小劑量組稀便率降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明健脾安腸丸對(duì)減輕大鼠腹瀉有顯著療效。由表2可見，造模結(jié)束后，即治療初，與造模前相比，除正常組外各組大鼠體重平均值均顯著降低(P<0.05)；與治療初相比，治療末大中小劑量組大鼠體重平均值均顯著增加(P<0.05)。

表1　造模后及治療末各組大鼠稀便率/%

注：與造模后比較，aP<0.01。

表2　造模前、治療初、治療末各組大鼠體重平均值±s)

注：與造模前比較，aP<0.05，與治療初比較，bP<0.05。

2.2健脾安腸丸對(duì)肝郁脾虛模型大鼠血漿VIP、SP水平的影響與正常對(duì)照組相比，模型組VIP、SP水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)，說明通過束縛+灌服大黃的方法導(dǎo)致了大鼠血漿VIP、SP水平的升高，可作為造模成功的證據(jù)；與模型組相比，大中小劑量組VIP、SP水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，以上結(jié)果均表明使用健脾安腸丸后，兩種物質(zhì)的水平均得到了改善。見表3、表4。

表3　大鼠血漿VIP、SP水平比較

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

3　討論

D-IBS的主要臨床癥狀是腹瀉、腹部疼痛或不適，目前其發(fā)病機(jī)制不完全清楚，其主要生理病理變化包括內(nèi)臟感覺異常敏感和胃腸動(dòng)力障礙[4]。我們體內(nèi)存在的腦腸軸將中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腸神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)-內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)連接起來，形成雙向交通通路，在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)功能、內(nèi)臟敏感性、腦腸肽分泌、機(jī)體對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)性、中樞認(rèn)知功能等方面發(fā)揮著重要的作用[5]。而具體發(fā)揮調(diào)控作用的物質(zhì)基礎(chǔ)則是各種胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)，熊觀瀛等[6]認(rèn)為胃腸肽類激類可分為興奮性和抑制性兩類，興奮性遞質(zhì)主要是乙酰膽堿和P物質(zhì)；抑制性遞質(zhì)主要有一氧化氮、血管活性腸肽、降鈣素基因相關(guān)肽等。

本實(shí)驗(yàn)健脾安腸丸組方中薏苡仁，味甘、淡，歸脾胃經(jīng)，可健脾滲濕止瀉，為君藥；葛根，味甘、辛，亦可歸脾胃經(jīng)，有升陽止瀉之效，為臣藥，可增強(qiáng)君藥薏苡仁健脾滲濕止瀉之功；黨參，味甘、平，可健脾益氣。黨參中多糖含量高達(dá)10%～20 %，是黨參藥材健脾益胃的活性有效部位，動(dòng)物功效試驗(yàn)表明，黨參多糖具有促進(jìn)消化功能，即增進(jìn)動(dòng)物食欲和進(jìn)食量，提高胃蛋白酶活力及胃蛋白酶排出量，促進(jìn)小腸蠕動(dòng)[7]。木香，亦具有健脾行氣之效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，木香提取物中的生物堿對(duì)組胺引起的豚鼠腸平滑肌和氣管平滑肌具有顯著解痙作用；白術(shù)，味苦、甘，歸脾、胃經(jīng)，補(bǔ)氣健脾，可治療脾虛泄瀉之癥；白芍，味苦、酸、甘，歸肝、脾經(jīng)，可養(yǎng)血平肝；防風(fēng)，味辛、甘，歸肝、脾經(jīng)，具有盛濕止瀉的作用；烏梅，味酸、澀，歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)，澀腸止瀉，可治療泄瀉；陳皮，味辛、苦，歸脾、肺經(jīng)，理氣健脾，燥濕止瀉；芡實(shí)，味甘、澀，歸脾、腎經(jīng)，健脾止瀉，全方諸藥合用，共奏健脾利濕止瀉，疏肝理氣之效，可治療脾虛濕盛、肝失疏泄之泄瀉。

近幾年研究表明，P物質(zhì)具有增加胃腸蠕動(dòng)，強(qiáng)烈促進(jìn)消化道平滑肌收縮，加強(qiáng)結(jié)腸的集團(tuán)推進(jìn)運(yùn)動(dòng)，刺激小腸、結(jié)腸黏膜分泌水和電解質(zhì)的作用[8]，在炎性疼痛時(shí)還可增強(qiáng)炎性刺激傳入的外周作用，加重痛覺感受，由此推斷IBS腹痛的癥狀可能是與之密切相關(guān)的；血管活性腸肽VIP則屬于腸神經(jīng)系統(tǒng)中具有代表性的一種神經(jīng)肽，是重要的肽類神經(jīng)遞質(zhì)之一，作為神經(jīng)肽遞質(zhì)的信號(hào)分子，參與機(jī)體多種功能的信息傳遞和生理調(diào)控，在肝臟、膽道、胰腺、胃腸道等均有分布，與消化系疾病有著密切的關(guān)系，其含量及受體敏感性一旦發(fā)生變化，會(huì)導(dǎo)致多系統(tǒng)疾病的發(fā)生，尤其引起消化系統(tǒng)疾病分泌功能的紊亂[9]。Fahrenkrug[10]認(rèn)為其具有舒張血管、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)激素分泌和舒張平滑肌等重要的生理功能。此外，實(shí)驗(yàn)表明VIP還能夠影響結(jié)腸上皮AQPs的表達(dá)[11-12]，而結(jié)腸組織細(xì)胞膜上存在多種水通道蛋白AQPs，是參與轉(zhuǎn)運(yùn)腸腔內(nèi)水液的主要蛋白。

綜上所述，健脾安腸丸能夠顯著降低腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型SP、VIP水平，減少大鼠稀便排泄，提示健脾安腸丸可能是干預(yù)了水通道蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)了腸腔內(nèi)水液的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而改善了腹瀉癥狀。但本實(shí)驗(yàn)也有不足之處，鑒于實(shí)驗(yàn)條件有限并未對(duì)腹痛作相關(guān)指標(biāo)檢測，有待于進(jìn)一步研究和完善。

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Effect of Jianpi Anchang pill on the level of VIP and substance P in D-IBS rats

SONG Yalua，ZHANG Mengyua，YANG Yingb，et al

(a.SchoolofPharmacy,b.ExperimentalCenter,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China)

ObjectiveTo study the effect of Jianpi Anchang pill to the level of VIP and substance P in D-IBS rats.MethodsUsing Rhei Radix et Rhizome and bound box to establish the model that stagnation of liver qi and spleen deficiency in rats,so to obsereve the effect of Jianpi Anchang pill to the level of VIP and substance P in D-IBS rats plasma.ResultsComparing with control group，model group was markedly rised (P<0.05orP<0.01).Comparing with model groups， big,middle and small dose groups were significantly decreased (P<0.05orP<0.01).ConclusionVIP and SP level in D-IBS rats plasma can be decreased by Jianpi Anchang pill,and this prescription can markedly improve the symptoms of diarrhea.

Jianpi Anchang pill;irritable bowel syndrome;stagnation of liver qi and spleen deficiency;Brain-Gut Axis;Aquaporin

宋亞璐，男，碩士研究生

孫明江，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥(復(fù)方)活性成分作用機(jī)制、藥理毒理研究及新藥研發(fā)，E-mail：13869180658@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.003

2016-04-07，

2016-07-11)