馬齒莧合劑治療實驗性皮膚缺失性創傷的效果觀察

楊春華，賀鵬亮，李瑞航，寧鵬，于永忠

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶　163319)

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馬齒莧合劑治療實驗性皮膚缺失性創傷的效果觀察

楊春華，賀鵬亮，李瑞航，寧鵬，于永忠

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶163319)

目的考查馬齒莧合劑治療模式動物皮膚缺失性創傷的效果。方法采收培育的荷蘭馬齒莧鮮草，經粗磨過濾方法制備馬齒莧有效成分混合制劑，配以細葉杜香、波斯菊、蜂蜜等中藥成分，配以相應的賦形劑，制成外用中藥合劑。選取純白家兔20只和Balb/c小鼠30只，分別隨機分組，設馬齒莧合劑組、云南白藥(陽性對照)組和丁二醇陰性對照組，于背部以外科手術法制造皮膚缺損性創口，施藥(施藥劑量：家兔20 mg/只、小鼠10 mg/只)，每天觀測治療效果。結果馬齒莧合劑組與云南白藥組相比，創傷創緣的向心性聚縮速度平均慢1～2 d，肉芽組織形成及上皮再生情況差異無統計學意義(P>0.05)，但明顯優于陰性對照組(P<0.05)。結論馬齒莧合劑能明顯促進實驗動物皮膚缺損性創傷的愈合。

馬齒莧;云南白藥;投藥,皮膚;軟組織損傷;兔;小鼠,近交Balb/c

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)是我國傳統中藥之一，具有較高的營養價值，也可以藥食兩用。《本草綱目》中記載，馬齒莧具有“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋，治產后虛汗”等功效[1-2]。經現代技術檢測分析，馬齒莧全草含有去甲腎上腺素、生物堿、香豆素、維生素A、維生素E、黃酮類強心苷及蒽醌類等生物活性成分，其中，黃酮類物質是一種天然的抗氧化劑，不僅能有效預防心血管疾病，還能調節免疫、抑菌消炎，已被列為保健食品的一類功能因子[3]。此外，馬齒莧中的維生素A樣物質，能維護上皮細胞正常的生理功能，并能促進組織潰瘍的愈合[4]。民間驗方中，馬齒莧可用于清熱解毒、涼血消腫，通常外用于治療多種皮膚病，如濕疹、燙傷、丹毒、腫瘍、皸裂、扁平疣、帶狀皰疹和黃褐斑等[5-9]。培養的荷蘭馬齒莧在產量、品質等方面均優于野生品種，但在有效成分含量及功效方面，尚沒有比較性數據報道。另依據《中國藥典》記錄，野生波斯菊具有清熱解毒作用，外用可以治療癰瘡腫毒；杜香外用具有鎮痛作用，還可以作為促滲劑使用[10]；蜂蜜具有止痛、解毒、抑菌和營養細胞等作用。

本研究利用荷蘭馬齒莧、波斯菊、杜香的萃取液和天然蜂蜜混合，佐以賦形劑，制成馬齒莧合劑，通過處理實驗動物皮膚局部缺失性手術創面，考查創緣的向心性聚縮速度、肉芽組織形成及上皮再生情況，評價其在促進皮膚創傷愈合方面的治療效果。

1　材料與方法

1.1材料荷蘭馬齒莧鮮草采收于馬齒莧種植基地；細葉杜香鮮葉由黑龍江大興安嶺地區阿木爾林業局林場提供；波斯菊花蕾屬本地種植品種；純天然蜂蜜購置于本地醫藥商場。云南白藥(批號ZCA1411)、速眠新Ⅱ(批號080405)、 1%碘伏(批號140706)、脫毛劑購于本地醫藥超市；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(產品編號：AR1180)購于博士德生物公司；丁二醇為分析純級；0.7%生理鹽水、Bouin’s溶液及鉻礬明膠溶液等由實驗室配制。

1.2主要儀器主要儀器包括：榨汁機(JYZ- d526)；超聲細胞破碎儀(SONICS) ；湘儀臺式大容量冷凍離心機(T dL-5M) ；電熱恒溫水浴鍋(hWS12)；高壓蒸汽滅菌鍋(SANYO MLS-3780)；數碼相機(SONY dSC-TX100)；以及4 ℃冰箱、電熱鼓風干燥箱(101-2AB)、輪轉式切片機(K d-202)、生物組織攤片機(K d-P)、生物組織烘片機(K d- h)、Leica dMI 4000顯微鏡(dMI 4000 B)、外科手術器械及一次性注射器等。

1.3馬齒莧合劑的制備取馬齒莧鮮草，用自來水沖洗去除泥沙，再用蒸餾水浸泡洗滌3次，每次5 min；取出放置于消毒過的手術隔離單上晾干；榨汁機用75%酒精消毒后，用蒸餾水反復沖洗3次；將晾干的馬齒莧放于榨汁機內榨取，濾過殘渣，濾液用超聲細胞破碎儀進行超聲破碎15 min后，加入丁二醇浸提過夜，用離心機3 000 r·min-1離心15 min，合并萃取液，獲得馬齒莧萃取液，置于消毒處理的玻璃瓶內，4 ℃冰箱保存備用。再取波斯菊花蕾、杜香葉，洗凈烘干粉碎，粗提萃取有效成分后，合并馬齒莧萃取液再與蜂蜜混合，通過巴氏滅菌處理[11-12]制成馬齒莧合劑。本研究初步制備的馬齒莧合劑主要成分包含馬齒莧80%(v/v)，波斯菊、杜香、蜂蜜各5%以及適量賦形劑。

1.4實驗動物分組選取SPF級純白色雌性家兔20只，由長春生物制品研究所有限公司提供(合格證號：scXK(吉)2011-0007)，平均體重2.5 kg，隨機分成組Ⅰ、組Ⅱ兩組。組Ⅰ用于記錄馬齒莧(M)和云南白藥(N)；組Ⅱ用于記錄馬齒莧(M)和丁二醇(K)。選取SPF級BALB/c小鼠30只，由吉林大學實驗動物中心提供，平均體重0.025 kg，隨機分成3組即組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ，每組各10只。組Ⅰ記錄馬齒莧(M)；組Ⅱ記錄云南白藥(N)；組Ⅲ記錄丁二醇(K)。所有實驗動物營養狀況良好，并在同等條件進行飼養管理及實驗處理。

1.5實驗動物處理首先對實驗動物進行藥物脫毛處理，處理后自然脫敏1～2 d，然后進行創傷模型建立。家兔組采用速眠新Ⅱ(0.1～0.2 mL·kg-1)實施全麻。術面選在家兔背部脊柱中線左右兩側，距離約2.0 cm處。局部術面大范圍以1%碘伏及 75%酒精常規消毒，用手術刀分別作邊長(2.5±0.2) cm正方形的皮膚全層切除創面，順向創緣平行于中線。對傷口采用無菌紗布壓迫止血10 min，暴露創面24 h，期間給予常規飲食。小鼠采用速眠新Ⅱ(0.3～0.8 mL·kg-1)實施全麻，局部術面大范圍以1%碘伏及75%酒精常規消毒。在背部中間作邊長(1±0.2)cm正方形的皮膚全層切除創面，對傷口采用無菌紗布壓迫止血10 min，暴露創面24 h，給予常規飲食。實驗動物創傷暴露24 h后，用生理鹽水沖洗創面2次，按表1方法敷藥治療，每天換藥一次，連續1周。

表1　實驗動物分組及治療方法

注：M：馬齒莧合劑組；N：云南白藥組;K：丁二醇組；L:家兔背部左側；R：家兔背部右側。

1.6組織標本病理切片的制備采用 HE染色組織切片技術制備小鼠皮膚創傷組織標本病理切片。在切創12 d 后從小鼠組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ中各取5只小鼠斷頸處死，取小鼠皮膚組織標本1.0 cm×1.0 cm生理鹽水漂洗后放入標記好的固定瓶中，Bouin’s固定72 h，70%乙醇沖洗2 min然后將組織塊切割成0.5 cm×0.4 cm大小，分別放入80%乙醇、90%乙醇中各脫水3 h，95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ中各脫水2 h，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各脫水2 h；再放入1/2無水乙醇+1/2二甲苯中過夜，次日再放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2 h組織透明，接著放入已融化的石蠟中包埋,經過3次蠟杯逐漸浸蠟,將凝固的含有組織塊的蠟塊修成適宜的大小和形狀,放在切片機上固定好,切成6 μm 厚切片，把切好的組織標本輕輕放入生物組織攤片機中展開后，貼在載玻片的一側，在另一側做好標記，放入生物組織烘片機烘干。

HE染色:將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，每級 10 min，逐漸脫去石蠟；分別放入1/2無水乙醇+1/2二甲苯、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中，每級5 min，逐漸脫苯；蒸餾水沖洗2 min；滴加蘇木素覆蓋標本，染色3～5 min，蒸餾水輕輕沖洗2 min；將切片浸入返藍液中30 s，蒸餾水輕輕沖洗2 min；將切片浸入95%乙醇中30 s，直接滴加伊紅染色30 s，蒸餾水輕輕沖洗2 min；70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、1/2無水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，每級1 min，組織脫水透明；染色后的切片從二甲苯中取出后，滴中性樹膠封固，放在通風處晾干，光鏡下觀察結構變化，Leica dMI 4000顯微鏡下攝片。

1.7統計學方法為考查不同類型的藥物(制劑)對實驗動物創傷創緣的向心性聚縮速度的影響，記錄創面面積的數值，所有數據通過Origin 85軟件進行處理。

2　結果

2.1家兔創傷實驗結果觀察家兔實驗結果如圖1所示。家兔組Ⅰ和組Ⅱ在藥物連續處理3天時，局部差異無統計學意義。第4天,組Ⅰ創口明顯收縮，創面減小，且創緣腫脹程度減輕；丁二醇組創口收縮較實驗組差，創緣腫脹程度仍較明顯。組Ⅰ第10～12天可見結痂已逐漸脫落，傷口已被新生上皮組織覆蓋，15 d可見傷口愈合良好，體被新毛，無感染、化膿和腫脹等其他反應；丁二醇組第10～12天結痂并未脫落，18 d傷口愈合良好。

注：A:家兔創傷藥物處理10 d后愈合情況.B，C:馬齒莧組和云南白藥組治療3 d和10 d結果比較(紅箭頭代表云南白藥組；藍箭頭代表馬齒莧實驗組).D、E:馬齒莧組和丁二醇組治療3 d和10 d結果比較(紅箭頭代表丁二醇組；藍箭頭代表馬齒莧實驗組)。

2.2小鼠創傷實驗結果觀察BALB/c小鼠實驗結果如圖2所示。用藥后第2天，觀察三組實驗老鼠，創面局部情況無明顯差異。第5天，小鼠組Ⅰ和組Ⅱ傷口邊緣明顯收縮，組Ⅲ無明顯變化；第7天，組Ⅰ和組Ⅱ痂皮干燥、粗糙，四周邊緣上翹更明顯，對照組痂皮無明顯上翹；組Ⅰ第10～12 d可見結痂已逐漸脫落，傷口已被肉芽組織覆蓋；第19天三組實驗小鼠創面已基本痊愈，傷口愈合良好，體被新毛，如圖2所示。在第2天，第7天和第12天記錄小鼠創面面積作圖3，第12天時組Ⅰ和組Ⅱ的創面大小明顯小于組Ⅲ，第19天時基本痊愈。

注：M：馬齒莧合劑組小鼠，N：云南白藥組小鼠，K：丁二醇組。

注：小鼠實驗組和對照組創傷恢復情況(橫坐標：小鼠創傷恢復天數(d)；縱坐標：創傷面積大小cm2)。第2天，組Ⅰ與組Ⅲ差異有統計學意義(P<0.05)；第7天，組Ⅱ與組Ⅲ差異有統計學意義(P<0.05)；第12天，組Ⅰ、組Ⅱ分別與組Ⅲ差異有統計學意義(P<0.01)；第19天，組Ⅰ、組Ⅱ分別與組Ⅲ差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3創面樣本組織病理切片結果創傷愈合12 d后,與用藥前正常小鼠皮膚相比較， HE 染色時實驗小鼠愈合皮膚厚度基本正常,表皮組織結構完整,細胞分層清晰；與空白對照組相比較，云南白藥組、馬齒莧合劑組的小鼠愈合皮膚有較多皮膚附屬器，愈合界線比較明顯；對照組創面愈合時有血管形成，瘢痕較少；云南白藥組、馬齒莧合劑組有血管形成及少許炎性細胞浸潤,瘢痕較多。見圖4。

注：A、F(a)：云南白藥組，B、F(b),C、F(c)：馬齒莧合劑組，D、F(d)：丁二醇組，E：正常皮膚。

3　討論

本研究利用培育的荷蘭馬齒莧為主要原料配制合劑，針對實驗動物進行創傷愈合的效果驗證，結果顯示，馬齒莧合劑能明顯促進實驗動物皮膚缺損性創傷的愈合，有較好的促進上皮組織修復的功效。

臨床中，局部皮膚切除或深度燒傷等創傷修復所需時間較長、物質較多，因此，可以從宏觀水平觀察傷口愈合效果，還可以從微觀水平研究傷口愈合過程[13]。在細胞水平上，創面愈合依賴于表皮細胞等的再生，該過程由來自創緣和創面皮膚附件的表皮細胞通過創面表面的增殖和遷移來完成，創面修復還需要角質細胞、毛囊表皮細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞的大量增殖，所以可以用相關的細胞增殖情況來反應創傷愈合進展。為便于臨床觀察與處理，普遍認為創面愈合時間和組織病理學分析仍是直接而有效的創面愈合評價指標，而傷口局部的巨噬細胞數量則標志炎癥階段即將結束，增生階段即將來臨[14-16]。

本實驗中，所有實驗動物切創處理后自然脫敏1～2 d，目的是在自然條件下，結合機體的自愈功能，給予相應的治療，從而全面客觀地評價藥物作用及影響。在此期間所有實驗動物均未發生皮膚創口水腫、感染、化膿及壞死等病理變化，并且創口愈合以及毛發的再生較快。家兔皮膚切創愈合過程中的肉芽組織覆蓋創面并且再上皮化覆蓋肉芽組織的時間約為 10～12 d，從切創到完全愈合所用時間約為18 d，時間跨度的原因分析可能為家兔活動度不同導致傷口寬窄不一(再上皮化時表皮爬行距離存在差異)、個體皮膚差異和愈合能力不同等；小白鼠皮膚從切創到完全愈合所用時間約為19 d，與兔子痊愈時間大致相同。通過對小白鼠創傷面積的統計，在創傷恢復的整體時間中，馬齒莧組的創面面積比丁二醇組的小，且差異有統計學意義；與云南白藥組對比差異無統計學意義，說明馬齒莧合劑對小白鼠創面具有良好的修復作用。家兔與小白鼠試驗結果表明，馬齒莧合劑對皮膚缺損性創傷有良好的消炎、促進上皮組織的再生及促進創傷愈合的作用。

同時，本實驗存在一定的局限性，人為切創時存在一定的誤差，直接導致切創第2 天小鼠皮膚創傷面積與對照組差異有統計學意義；實驗動物購買及飼養成本較高，孕育周期長，出生率低，且飼養技術不如專門的飼養員技術，直接限制本實驗樣品數量和質量。馬齒莧合劑藥源廣，價格便宜，使用方便，制作簡單，天然無毒副作用，可作為動物創傷的必須藥物而應用于外科臨床。下一步將從細胞生物學水平及分子生物學方面，研究馬齒莧合劑對創傷修復機制中重要的相關因子的影響。

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Curative effect of traditional Chinese medicine extraction containing mainlyPortulacaoleraceaL.onexperimentalskin defected wounds

YANG Chunhua,HE Pengliang,LI Ruihang,et al

(CollegeofBiologicalScienceandTechnology,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing,Heilongjiang163319,China)

ObjectiveTo investigate the curative effect of the traditional Chinese medicine mixture ofPortulacaoleraceaL. on experimental animal models of skin defected wounds.MethodsThe fresh aerial parts of domesticated cultivardutchportulacaoleraceaL.were collected in order to extract effective constituent by coarse grind and filter.The extraction was mixed with several compositions of natural ingredients such asLedumpalustre,CosmosbipinnataCavand honey in excipient.Twenty white rabbits or 30 Balb/c mouses were randomized into three groups and treated respectively with Purslane mixture(experimental group),Yunnan Baiyao Ointments(positive control),and Butylene Glycol(negative control),and then,20 mg or 10 mg of external preparation was administered to each of model animal with skin trauma on his back,followed by daily inspection.ResultsThe experimental group,compared with positive control group,showed a non-significant difference(P>0.05) in reducing granulation tissue formation and epithelial regeneration,but only recovered slightly slower for averagely 1 days to 2 days in the same conditions.However,there was a significantly improved therapeutic advantage(P<0.05) when compared with the negative control group.ConclusionsPurslane mixture has a high potential as a novel alternative therapeutic strategy after skin injury.

Portulaca oleracea;Yunnan bai yao;Administration,cutaneous;Soft tissue injuries;Rabbits;Mice,inbred BALB C

黑龍江省教育科學"十二五"規劃課題(GBC1212060);黑龍江八一農墾大學“大學生創新創業訓練計劃”項目(XC2015050)

于永忠，男，副教授，碩士生導師，研究方向：分子免疫學，E-mail：yyz1968@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.005

2016-03-02，

2016-06-07)