不同濃度瑞芬太尼對新生大鼠海馬區神經干細胞內鈣濃度及細胞凋亡的影響

昌睿杰 ，姚雪芹 ，蒙臣 ，陸江 ，李清

(1.湖北省十堰市太和醫院，湖北 十堰　442000；2.湖北醫藥學院麻醉學研究所，湖北 十堰　442000)

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不同濃度瑞芬太尼對新生大鼠海馬區神經干細胞內鈣濃度及細胞凋亡的影響

昌睿杰1,2，姚雪芹1,2，蒙臣1,2，陸江2，李清1,2

(1.湖北省十堰市太和醫院，湖北 十堰442000；2.湖北醫藥學院麻醉學研究所，湖北 十堰442000)

目的探討不同濃度瑞芬太尼對新生大鼠海馬區神經干細胞凋亡及細胞內鈣濃度的影響。方法采用已建立的新生SD大鼠海馬區神經干細胞單細胞克隆系細胞株，將5×108個·L-1活細胞的密度均勻地接種到的12孔培養板中，每孔加入1 mL含有10%胎牛血清的DMEM/F12的培養基，放入溫度37℃、5%濃度CO2培養箱中孵育24 h，鏡下觀察細胞球貼壁后，每孔分別加入生理鹽水或不同濃度的瑞芬太尼(R)，分為以下4組：(1)對照組，每孔加入生理鹽水；(2)低濃度組，每孔加入瑞芬太尼5 μg·L-1，即R5組；(3)中濃度組，每孔加入瑞芬太尼10 μg·L-1，即R10組；(4)高濃度組，每孔加入瑞芬太尼20 μg·L-1，即R20組。每組重復4次。加藥后培養300、600、900 s用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測各組神經干細胞內游離鈣濃度的動態變化，24 h后流式細胞儀檢測各組神經干細胞的凋亡情況。結果(1)各組細胞內鈣濃度變化情況：與對照組比較，R5組細胞內鈣濃度差異無統計學意義(P>0.05)；R10、R20組細胞內鈣濃度明顯升高(其中R10組P<0.05 ，R20組P<0.01)。(2)各組神經干細胞凋亡變化情況：與對照組比較，R5組神經干細胞凋亡差異無統計學意義(P>0.05)；R10、R20組神經干細胞凋亡明顯升高(其中R10組P<0.05 ，R20組P<0.01)。結論低濃度的臨床有效血藥濃度的瑞芬太尼對新生大鼠海馬區神經干細胞內鈣濃度、細胞凋亡沒有影響，中高濃度的臨床有效血藥濃度的瑞芬太尼應用使細胞內鈣濃度顯著升高，從而誘發細胞大量凋亡。

瑞芬太尼;海馬;神經干細胞;細胞凋亡;鈣;大鼠,Sprague-Dawley

隨著現在小兒(新生兒和嬰幼兒)手術的開展越來越廣泛，全麻藥物瑞芬太尼在小兒手術的應用日益普遍，“瑞芬太尼是否影響小兒腦發育”逐漸成為麻醉關注的熱點[1]。神經干細胞(neural stem cells,NSCs)存在于中樞神經系統，其與腦發育密切相關。瑞芬太尼的鎮痛作用主要集中在中樞的邊緣系統，其臨床推薦使用劑量范圍廣[2]，其有效血藥濃度為1～20 μg·L-1，瑞芬太尼對小兒神經發育的影響目前尚不清楚。本實驗擬觀察不同臨床有效血藥濃度的瑞芬太尼對新生大鼠海馬區神經干細胞內鈣離子濃度的變化及其存活、凋亡的影響,探討小兒臨床麻醉用藥的安全性、合理性。

1　材料與方法

1.1細胞株接種(1)采用湖北醫藥學院麻醉學研究所提供的新生SD大鼠海馬區神經干細胞單細胞克隆系細胞株的細胞球懸液吸入30 mL滅菌離心管中加蓋直立靜放10 min。(2)待細胞球完全下沉至管底后(必要時離心)，輕輕吸去4/5上清液，加入神經干培養液定容至10 mL，用毛細吸管輕輕吹打神經球機械分離克隆，相差顯微鏡下觀察制備成單細胞或多細胞球懸液。(3)用臺盼藍染色后進行細胞計數， 5×108個·L-1活細胞的密度接種于不放蓋玻片多聚賴氨酸包被的12孔培養板中，每孔加1.0 mL含 10%胎牛血清+DMEM/F12誘導分化的培養基，放入5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養箱中孵育使細胞貼壁。

1.2藥物處理與分組(1)上述細胞孵育6～8 h鏡下觀察完全貼壁后，分隨機組后每孔加入不同藥物處理(對照組記為C，低濃度瑞芬太尼記為R5，低濃度瑞芬太尼記為R10，低濃度瑞芬太尼記為R20)。(2)分為4組(每組3孔細胞)：C組：加入生理鹽水；R1組:加入瑞芬太尼5 μg·L-1;R2組:加入瑞芬太尼10 μg·L-1;R3組:加入瑞芬太尼20 μg·L-1。

1.3指標檢測

1.3.1激光掃描共聚焦技術(LSCM) 檢測神經細胞內內Ca2+濃度的動態變化

(1) NSCs于室溫下培養24 h，吸棄培養液，用Lock’s 液洗二遍，加入100 μL Lock’s 液(含5 μmol ·L-1的Fluo-3 /AM 存儲液，Fluo-3 /AM 為可以穿透細胞膜的高親鈣熒光染料)。(2)NSCs置于細胞培養箱中孵育45 min后吸去熒光染料，用Lock’s液洗2遍，每孔加入100 μL的Lock’s液后使用激光掃描共聚焦顯微鏡對細胞進行掃描。掃描開始3 min后，分別使用10 μL的生理鹽水和5、10、20 μg·L-1的瑞芬太尼處理NSCs。每隔10 s掃描一次，持續15 min。(3)將所得熒光圖像用Leica SP2 Confocal 軟件進行分析。掃描30個未經處理NSCs，統計其細胞內Ca2+熒光信號強度平均值作為基礎值并設置為1，將藥物處理后300、600、900 s的細胞內Ca2+熒光信號強度與基礎值進行比較。

1.3.2流式細胞技術檢測細胞凋亡[3]

細胞按上述分組加藥，培養30 min后按以下步驟進行：(1)吸去培養孔培養液，先用PBS緩沖液清洗2次，用0.125%胰酶消化細胞5 min；(2)鏡下觀察細胞松動收縮或懸浮變圓后，用無鈣PBS緩沖液終止消化，輕輕吹打成細胞懸液；(3)500 r·min-1低速離心5 min后吸除上清液，再無鈣PBS緩沖液清洗2次；(4)收集上述處理各組細胞于無鈣PBS中重懸，并將調整細胞密度為5×108個·L-1；(5)分別取上述各組細胞懸液1ml于對應編號的小試管中，在避光環境里分別加入終濃度Fluo2-AM 10 μmol·L-1，在CO2培養箱中孵育1 h(避光，37 ℃)并間斷輕輕振蕩幾次；(6)取出上述染色后各組細胞懸液再離心，用無鈣PBS緩沖液清洗3次以去除多余的染料；(7)再用無鈣PBS緩沖液重懸上述各組細胞至1 mL，按分組于流式細胞儀上進行檢測，設置發射波長為526 nm，激發波長為506 nm；隨機取1萬個細胞測定每個細胞熒光強度值，其各組測定值為熒光強度值的平均值。

表1　不同濃度瑞芬太尼對NSCs內Ca2+水平的影響

注：a表示與Ca2+基礎水平比較；b表示與相同時間點的對照組比較。

2　 結果

2.1各組細胞內鈣濃度變化情況由表1可見：與C組比較，R5組細胞內鈣濃度差異無統計學意義(P>0.05)；R10、R20組細胞內鈣濃度明顯升高(其中R10組P<0.05 ，R20組P<0.01)。

2.2各組神經干細胞凋亡變化情況見圖1，與C組比較，R5組神經干細胞凋亡差異無統計學意義(P>0.05)；R10、R20組神經干細胞凋亡明顯升高(其中R10組P<0.05 ，R20組P<0.01)。

NSCs經生理鹽水(A，Control)及5 μg·L-1(B，R5)、10 μg·L-1(C，R10)、20 μg·L-1(D，R20)的瑞芬太尼處理24 h,使用Annexin-Ⅴ和PI標記細胞并用流式細胞技術檢測。(E)流式細胞技術結果統計。

圖1　不同濃度瑞芬太尼對NSCs凋亡的影響

3　討論

在本實驗中，我們通過使用不同濃度的瑞芬太尼處理新生大鼠海馬區的神經干細胞，發現低濃度的瑞芬太尼對新生大鼠海馬區神經干細胞內鈣濃度、細胞凋亡沒有影響，而中高濃度的瑞芬太尼使細胞內鈣濃度顯著升高，且細胞大量凋亡。

麻醉藥物如氟烷、N2O、異氟醚、丙泊酚等對實驗動物快速發育期的大腦都有敏感的神經毒性，可誘發未成熟大腦神經細胞死亡及發育后學習認知功能受損，且損害程度與劑量成正相關[4-5]。瑞芬太尼是新型超短效型的阿片受體激動藥，其對發育期大腦的影響目前還不十分清楚。目前，臨床上已普遍使用瑞芬太尼作為小兒麻醉鎮痛，且推薦使用的有效血藥濃度橫跨1～20 μg·L-1的廣泛區間[2]，因此，該實驗選取了該區間范圍內的低(5 μg·L-1)、中(10 μg·L-1)、高(20 μg·L-1)三種不同劑量進行干預。瑞芬太尼主要作用于中樞神經的邊緣系統[2]，而海馬組織是邊緣系統的重要組成部分，其結構特殊，是調控大腦學習認知功能的關鍵區域，而且在腦內對損傷也最為敏感[6]。因此，本實驗選取新生海馬區域的細胞作為研究靶點。

研究已證實，海馬中的內源性神經干細胞與學習記憶和認知功能有極密切的關系[7]。神經干細胞是神經元的前體細胞，在發育期，海馬中有大量的神經干細胞分化為神經元細胞，這些新生的神經元細胞直接影響認知功能(包括學習和記憶)的構建。而當神經干細胞受損如發生凋亡壞死時，大腦的認知功能發育也會明顯受限[7]。因此，為了探討瑞芬太尼對發育期大腦認知功能的潛在影響，我們選取海馬齒狀回的神經干細胞作為研究對象。

在本實驗中，我們觀察到，低濃度的瑞芬太尼對神經干細胞的凋亡沒有明顯影響，而經中高臨床濃度的瑞芬太尼處理后，神經干細胞發生了明顯凋亡。這說明，在使用的臨床對應劑量中，中高濃度的瑞芬太尼會對體外培養的海馬區神經干細胞產生明顯的毒性作用。這提示我們，在臨床小兒麻醉中，使用較低有效濃度的瑞芬太尼對神經發育是比較安全的，而使用高濃度的瑞芬太尼除了導致痛覺敏化等副作用外，還使小兒面臨著學習認知功能發育受損的風險，這將指導我們設計嚴密的臨床實驗作詳細證實。

在進一步的實驗檢測中，我們發現中高臨床濃度的瑞芬太尼能夠引起海馬區神經干細胞內的Ca2+濃度顯著升高，而低濃度瑞芬太尼對細胞內Ca2+水平沒有影響，這很可能是中高濃度瑞芬太尼誘導神經干細胞凋亡的主要原因。研究發現，細胞內Ca2+濃度與凋亡反應密切相關[8-9]。游離鈣離子作為細胞內外信號轉導通路的信使，廣泛參與了神經干細胞的生理過程。正常情況下，細胞內Ca2+維持在較低水平，其濃度在生理范圍內的升高可以促進細胞增殖分化與合成分解代謝等正常生理過程[10-11]；而細胞內游離Ca2+濃度升高至鈣超載時將觸發一系列病理生理變化，其典型表現為誘導細胞凋亡[12]。研究已證實，阿片類藥物可以刺激神經細胞的鈣內流，細胞內Ca2+濃度越高，細胞凋亡越明顯[13]，本實驗結果與完全吻合。

綜上所述中高濃度的瑞芬太尼使新生大鼠神經干細胞細胞內鈣濃度顯著升高，細胞大量凋亡；低濃度的瑞芬太尼對神經干細胞內鈣濃度、細胞凋亡沒有影響。因此在小兒圍手術期推薦使用低濃度的瑞芬太尼是安全合理的。

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Effect of different clinical doses of remifentanil on the intracellular Ca2+concentration and apoptosis in newborn rat hippocampal neural stem cells

CHANG Ruijie1,2,YAO Xueqin1,2,MENG Chen1,2,et al

(1.TaiheHospital,Shiyan,Hubei442000,China;2.AnesthesiologyResearchInstituteofHubeiUniversityofMedicine,Shiyan,Hubei442000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of different clinical doses of remifentanil on the apoptosis and the related intracellular Ca2+concentration([Ca2+]i) in newborn rat hippocampal neural stem cells(NSCs).MethodsThe hippocampal monoclonal NSCs strains of newborn SD rat were seeded into 12-well plates at the density of 5×105cells/well,and cultured with 1 mL of DMEM/F12 medium containing 10% fetal bovine serum.NSCs were incubated in humidified incubator at 37 °C with 5% CO2for 24 hours.Cells were assigned into four groups by different treatments as follows:(1) control group:NSCs were treated by saline;(2) low dose group(R5group):NSCs were stimulated with 5 μg·L-1of remifentanil;(3) middle dose group(R10group):NSCs were incubated in 10 μg·L-1of remifentanil;(4) high dose group(R20group):NSCs were stimulated with 20 μg·L-1of remifentanil.In every group the treatment was repeated for four times.Laser scanning confocal microscope(LSCM) scanning was used after 300 s,600 s and 900 s of remifentanil treatment for detection of [Ca2+]i.NSCs apoptosis was assayed by flow cytometry 24 hours after the treatment of remifentanil.ResultsCompared with control group,R5group showed no significant changes in [Ca2+]i(P>0.05) and the concentrations of [Ca2+]iof NSCs in R10and R20group were increased markedly (P<0.05 andP<0.01,respectively).Compared with control group,NSCs in R5group were almost not impaired,while the apoptosis of NSCs was significantly increased in R10and R20group(P<0.05 andP<0.01,respectively).ConclusionsLow clinical dose of remifentanil has little effect on NSC apoptosis and the related [Ca2+]i,while the middle and high doses of clinical remifentanil notably increase the level of [Ca2+]i,resulting in significant apoptosis in NSCs.

Remifentanil;Hippocampus;Neural stem cells;Apoptosis;Calcium;Rats,sprague-dawley

湖北省自然科學基金項目(2012FFC060)；湖北省省級重點學科項目(2014XKJSSJ04)

李清，教授，碩士研究生導師，研究方向：麻醉學，E-mail:liqing8801@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.006

2016-03-09，

2016-06-20)