納米微囊介導的堿性成纖維細胞生長因子聯合低氧誘導因子-1提高隨意型皮瓣缺氧耐受的實驗研究

王之學，肖繼州，趙振霞，于強

(聊城市第二人民醫院燒傷科，山東 聊城　252600)

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納米微囊介導的堿性成纖維細胞生長因子聯合低氧誘導因子-1提高隨意型皮瓣缺氧耐受的實驗研究

王之學，肖繼州，趙振霞，于強

(聊城市第二人民醫院燒傷科，山東 聊城252600)

目的探討以納米微囊為載介導的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)聯合低氧誘導因子-1(HIF-1)對大鼠隨意性皮瓣缺氧耐受的作用。方法SD大鼠40只，背部設計6 cm×2 cm的隨意性皮瓣。采用隨機方法分為4組：A組為聯合應用含bFGF和HIF-1的試驗組；B組為單純應用bFGF的基因對照組1；C組為單純應用HIF-1的基因對照組2；D組為應用生理鹽水的空白對照組。采用皮瓣下注射的方式，術后測量皮瓣成活面積，病理切片HE染色，皮瓣組織的bFGF和HIF-1免疫組化檢測及皮瓣下毛細血管的數目密度統計。結果納米微囊介導的試驗組與其他對照組相比，皮瓣成活率更高，目的蛋白表達和皮瓣新生血管密度計數與對照組差異有統計學意義(P<0.05)。結論以納米微囊為載體，聯合應用bFGF和HIF-1的基因治療能促進皮瓣血管的增生，顯著提高大鼠隨意性皮瓣的缺氧耐受，增加其成活率。

外科皮瓣；納米囊；成纖維細胞生長因子；芳香烴受體核轉位子；新生血管化,生理性；大鼠

皮瓣存活是保證皮瓣移植手術成功與否的最重要因素，其中皮瓣術后缺血性壞死是困擾外科學的一個難題。近年來，研究表明堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor，HIF-1)可直接或間接的促進血管的形成[1]，提高皮瓣遠端缺血部分的成活率。已有學者將堿性成纖維細胞生長因子成功的運用于皮瓣成活的研究中，結果表明堿性成纖維細胞生長因子能顯著的促進新生血管的形成[2-3]。低氧誘導因子1是在機體缺血狀態下表達的一類蛋白質，通過調控其他生長因子的表達來促進血管的再生，對缺血性皮瓣的存活具有重要的作用。師永紅等[4]報道堿性成纖維細胞生長因子可通過信號通路PI3K/Akt和MEK1/ERK活化低氧誘導因子，增強其轉錄活性從而促進新血管的生成。堿性成纖維細胞生長因子和低氧誘導因子在新血管的生成中有著密切的關系。由于bFGF和HIF-1在體內易被蛋白酶分解，半衰期短，局部使用時不能發揮其生物學效應，而采用微囊系統可將控制其局部釋放的問題。故本實驗將堿性成纖維細胞生長因子和低氧誘導因子有機的結合在一起，以殼聚糖納米微囊為載體觀察提高大鼠隨意型皮瓣缺氧耐受的情況。

1　材料與方法

1.1材料與設備Bio-RADModel酶標分析儀(美國)，S-2700掃描電鏡(日本)，FJ-2300型計數儀，HJ-4磁力攪拌器，TH2-82型恒溫振蕩儀，真空干燥箱(上海)，Span-80為Sigma公司分析純，殼聚糖為Sigma公司，pTagRFP-Cl-Hu-bFGF和pEGFP-N2-Hu-HIF-1購自重慶碧基生物科技有限公司，ABC免疫組化試劑盒購組武漢博士德生物制品公司，鼠抗人堿性成纖維細胞生長因子及鼠抗人低氧誘導因子1購自武漢博士德生物制品公司，內參物甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)購自康成生物工程有限公司，分子量為146 kDa。其他試劑如無水乙醚、異丙醇、丙酮、戊二醇等均為國藥分析純，實驗用水為超純水。健康的SD大鼠40只(由濟南市金豐實驗動物繁育有限公司提供，SCXK(魯)2014-0006)，體重200～250 g，雌雄不限，隨機分為A組為聯合應用bFGF和HIF-1納米微囊的實驗組，B組為應用bFGF納米微囊的對照組1，C組為應用HIF-1納米微囊的對照組2，D組為應用生理鹽水的空白對照組。

1.2納米微囊的制備及鑒定

1.2.1bFGF和HIF-1雙基因納米微囊的制備

根據文獻提供的方法制備殼聚糖納米微囊[5]。稱取50 mg殼聚糖，加入360 μL乙酸，加超純水至2.5 mL，置37℃恒溫箱內過夜，再加超純水至245 mL，調節pH至5.5，加超純水定容至250 mL容量瓶中，過濾除菌得殼聚糖溶液，濃度為0.2 g·L-1；各取pTagRFP-Cl-Hu-bFGF和pEGFP-N2-Hu-HIF-1 10 mg，溶解于100 mL 5 mmol·L-1的硫酸鈉溶液中，配制成0.2 g·L-1的質粒溶液；將質粒溶液和殼聚糖溶液分別置于水浴上于55 ℃加熱15 min，將兩種溶液等體積混合，3 000 r·min-1速攪拌1 min，即得濃度為100 μg·L-1的雙基因殼聚糖納米微囊溶液，于4 ℃保存，備用。將制備好的納米微囊直接放于原子力顯微鏡(SPI3800N)下觀察見殼聚糖納米微囊呈不規則球形，結構緊密，粒徑約為100～200 nm，大小較均勻。再將納米微囊用硫酸鈉溶液(濃度為30 mmol·L-1)按1∶15稀釋，取稀釋液5 μL置云母片上，用氮氣吹干，于原子力顯微鏡下觀察納米形態并測量直徑。

1.2.2bFGF納米微囊的制備

稱取50 mg殼聚糖，加入360 μL乙酸，加超純水至2.5 mL，置37 ℃恒溫箱內過夜，再加超純水至245 mL，調節pH至5.5，加超純水定容至250 mL容量瓶中，過濾除菌得殼聚糖溶液，濃度為0.2 g·L-1；稱取pTagRFP-Cl-Hu-bFGF 10 mg，溶解于100 mL 5 mmol·L-1的硫酸鈉溶液中，配制成0.2 g·L-1的質粒溶液；將質粒溶液和殼聚糖溶液分別置于水浴上于55 ℃加熱15 min，將兩種溶液等體積混合，3 000 r·min-1速攪拌1 min，即得濃度為100 μg·L-1的雙基因殼聚糖納米微囊溶液，于4 ℃保存，備用。

1.2.3HIF-1納米微囊的制備

稱取50 mg殼聚糖，加入360 μL乙酸，加超純水至2.5 mL，置37 ℃恒溫箱內過夜，再加超純水至245 mL，調節pH至5.5，加超純水定容至250 mL容量瓶中，過濾除菌得殼聚糖溶液，濃度為0.2 g·L-1；取pEGFP-N2-Hu-HIF-1 10 mg，溶解于100 mL 55 mmol·L-1的硫酸鈉溶液中，配制成0.2 g·L-1的質粒溶液；將質粒溶液和殼聚糖溶液分別置于水浴上于55 ℃加熱15 min，將兩種溶液等體積混合，3 000轉速攪拌1 min，即得濃度為100 μg·L-1的雙基因殼聚糖納米微囊溶液，于4 ℃保存，備用。

1.3動物模型的制備及觀察指標

1.3.1動物模型的制備

術前大鼠背部用8%硫化鈉溶液脫毛處理，溫水洗凈。戊巴比妥鈉按30 g·L-1腹腔注射麻醉大鼠，麻醉平穩后，將其放于手術平臺上，四肢固定，取俯臥位，聚維酮碘溶液消毒，鋪巾。于鼠背正中設計6 cm×2 cm的隨意皮瓣(含脂膜肌層)，縱軸與脊柱平行，在分別距離蒂部2、4 cm 處，做與蒂部平行的兩條直線，此直線分別與皮瓣的邊緣相交于四點，以此四點作為注射位點。A組皮瓣下每個注射位點注射100 μg·L-1的bFGF和HIF-1雙基因納米微囊(含bFGF和HIF-1)，B組注射100 μg·L-1的bFGF納米微囊(含bFGF)，C組注射100 μg·L-1的HIF-1納米微囊(含HIF-1)，D組注射生理鹽水1 mL。用3-0絲線原位間斷縫合，切口邊緣涂紅霉素藥膏。所有傷口均隔日換藥，肌肉注射青霉素20萬單位，1次/d，連續3 d。單籠喂養。

1.3.2大體外觀察

在術后7 d內對大鼠皮瓣進行觀察，主要觀察3個部位，分別距離蒂部4～6 cm(遠端)，2～4 cm(中端)，0～2 cm(蒂部)。分別從皮瓣的質地、顏色、組織彈性及毛發生長情況進行觀察。皮瓣壞死的判斷標準為：顏色變黑、質地堅硬、組織回縮及彈性差、無毛細管反應。

1.3.3皮瓣存活率的檢測

皮瓣手術7 d后，存活區與壞死區已經很明顯。首先用透明紙準確描繪各組皮瓣的形態，壞死區域用記號筆標記，對其進行照相，利用圖像分析軟件計算壞死面積與存活面積。計算公式為：皮瓣存活率=皮瓣存活面積/皮瓣總面積×100%。

1.3.4組織學檢測

術后7 d將大鼠處死，取皮瓣組織(含筋膜層)，用10%的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，冰凍切片，HE染色，在光鏡下觀察肉芽組織層厚度，壞死、組織水腫及炎癥細胞浸潤等情況，并進行新生毛細管和成纖維細胞計數。

1.3.5免疫印跡檢測

術后取存活皮瓣組織(0.5 cm×0.5 cm)，加細胞裂解液，蛋白酶抑制劑，電泳分離，轉膜，免疫雜交和顯色后觀察細胞內目的基因的表達情況。以恒定含量的GAPDH作為內參照物，標定各實驗組蛋白表達情況。

2　結果

2.1大體觀察實驗所用所有大鼠均存活至實驗結束。術后2～3 d，所有組的皮瓣全部存活，遠端皮瓣經毛細管充盈實驗呈現陽性，邊緣組織有少量滲血；4～5 d時，所有組大鼠隨意皮瓣的遠端色澤均有變暗，推測可能出現組織壞死。實驗組皮瓣遠端色澤較所有對照組顏色淺；實驗組及對照組1中大鼠皮瓣的中段膚色正常及毛細血管充盈實驗呈陽性，對照組2與實驗組及對照組1有輕微差異，空白對照組中段皮瓣顏色及充盈實驗結果與其他組有差異，且個別部位出現青紫。6～7 d時，所有組大鼠遠端皮瓣的顏色均有加深、變暗；實驗組中段及近端的皮瓣都存活，且膚色正常，毛細管充盈實驗顯陽性，對照組1中皮瓣顏色較實驗組顏色稍深，中段及近端的毛細管充盈實驗均顯示陽性，對照組2中皮瓣中段顏色較對照組1更深，毛細管充盈實驗顯示弱陽性，空白對照組遠端皮瓣有輕度腫脹，皮紋變淺，中段也較其他組顏色深，毛細管充盈實驗顯若陰性，近端皮瓣存活良好。

2.2皮瓣存活按照1.3.3項中檢測皮瓣存活率的方法檢測，利用S-2700掃描電鏡計算各組小鼠壞死面積和存活面積，計算皮瓣存活率。匯總四組大鼠皮瓣成活率結果:A組為(85.663±2.34)%，B組為(69.113±3.55)%，C組為(63.224±2.78) %，D組為(42.886±3.01) %。經過SPSS統計軟件計算得出，組間秩和檢驗的P=0.006，說明四組間皮瓣存活率差異有統計學意義。實驗組與各對照組的兩兩比較結果顯示：A組與B組組間比較P=0.004，差異有統計學意義，即可以認為A組的皮瓣存活率優于B組；A組與C組間比較P=0.009，差異有統計學意義，即可以認為A組的皮瓣存活率優于C組；A組與D組間比較P=0.000，差異有統計學意義，即可以認為A組的皮瓣存活率優于D組。

2.3組織學觀察及新生血管計數A組近端皮瓣下無明顯炎性浸潤，無組織水腫，皮下纖維增生明顯；中段皮瓣下有輕度水腫，皮下纖維組織有增生，炎性細胞有部分浸潤；遠端皮下有明顯水腫，皮下纖維增生明顯，有大量炎性細胞浸潤。B、C組組織學差異不明顯，皮瓣近端有輕度水腫，輕度的炎性細胞浸潤，皮下纖維有增生；中段皮下組織有大量炎性細胞浸潤，組織水腫明顯，成纖維增生不明顯；遠端皮膚全層壞死，組織結構崩解，皮下出現彌漫性炎性細胞浸潤。D組為空白組對照，近端皮下有大量炎性細胞彌漫性浸潤，組織結構崩解，組織水腫，且成纖維細胞增生明顯減少。由FJ-2300型計數儀計算各組皮瓣下血管斷面數密度，4組大鼠結果分別為(35.57±5.23)、(24.92±3.13)、(21.97±3.25) %、(13.74±4.61) 個/mm2，經SPSS軟件分析四組間比較P<0.01，說明各組間新生血管計數差異有統計學意義。實驗組與各對照組的兩兩比較結果顯示：A組與B組間比較P=0.0167，差異有統計學意義，即可以認為A組的新生血管計數優于B組；A組與C組間比較P=0.0167，差異有統計學意義，即可以認為A組的新生血管計數優于C組；A組與D組間比較P=0.0167，差異有統計學意義，即可以認為A組的新生血管計數優于D組。

2.4蛋白印跡檢測術后7 d，細胞裂解液中檢測bFGF和HIF-1在實驗組中表達結果顯示為陽性，對照組1、2顯示為弱陽性，空白對照組為陰性，結果見圖1、2。

圖1　bFGF與GAPDH檢測結果

圖2　HTF-1與GAPDH檢測結果

3　討論

血管的形成是一個復雜的過程，包括血管內皮細胞的激活、細胞外基質的降解管腔的形成等過程[5]，其中bFGF被認為是最重要的血管生成因子之一[3,6]。bFGF促進血管內皮細胞的分裂、增殖以及遷移，作用于血管生成的多個環節。劉丹、王璐等[7-8]在鼠背部設計隨意性皮瓣，原味縫合后皮下注射bFGF,結果顯示可明顯提高皮瓣存活率。HIF-1是低氧時表達的一種蛋白，對傷口的愈合、新血管的再生起著重要的作用。周盛源等[9]通過將bFGF基因導入BMSCs，建立了損傷模型后實驗對比發現導入bFGF實驗組損傷修復效果明顯優于對照組。通過人乳腺癌細胞為對象，研究了bFGF和HIF-1在腫瘤新血管生成過程中的密切關系，發現bFGF以劑量和時間依賴性的方式誘導HIF-1的表達，并且通過MEKI/ERK和PI-3K/Akt兩條通路發揮作用[9]。

由于bFGF屬于生物活性蛋白，對熱和酸敏感，在體內不穩定易被蛋白酶分解，導致生物學效應不能充分發揮；HIF-1在正常氧狀態下易被體內細胞漿的泛素蛋白水解系統降解，應用藥物的緩釋制劑可解決以上的問題。王璐等[10]研究局部注射bFGF復合明膠微囊對大鼠背部任意皮瓣存活的影響，結果發現bFGF明膠微囊可提高皮瓣的成活率?；蛑委熓悄壳把芯康臒狳c領域，但目前多采用病毒載體轉染，如腺病毒、逆轉錄病毒載體等，雖取得了一定成功，但是一個病毒載體只能轉染一個目的基因，轉染效率較低，并且在表達時間、免疫反應及安全性等方面存在諸多問題。Leong等[10]在1998年創立了納米微囊包裹非病毒載體基因轉移技術。殼聚糖是納米微囊結果，可將基因包裹在內部。Corski等[11]采用殼聚糖DNA納米載體轉染人骨髓間充質干細胞、腎肉瘤細胞，發現殼聚糖DNA納米微囊在基因轉運中具有毒性小及細胞依賴性的特點。

我們設計了隨意皮瓣動物模型，將納米微囊載體介導的bFGF聯合HIF-1直接注射于大鼠皮下組織。研究發現納米膠囊載體可以較好的控制bFGF和HIF-1的釋放。本實驗通過對各組皮瓣成活率的比較發現，實驗組的皮瓣成活率最高，與其他對照組差異有統計學意義(P<0.05)；通過對成活皮瓣進行常規病理切片HE染色的組織學檢查發現實驗組大鼠皮瓣的色澤、質地及組織彈性均比其他對照組要好；同時血管密度檢測發現實驗組的新生血管斷面的數密度要顯著高于其他對照組。蛋白印跡法檢測細胞目的基因的表達發現實驗組bFGF和HIF-1蛋白的表達比其他對照組更明顯。以上結果表明，應用bFGF聯合HIF-1的基因治療要比單純應用bFGF或HIF-1的效果理想，能顯著促進皮瓣新生血管的形成，改善皮瓣供血，從而增加大鼠隨意皮瓣的成活率。

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An experimental study on nanoparticle mediatedapplication with bFGF and HIF-1 to increase hypoxia toleranceof random skin flap

WANG Zhixue,XIAO Jizhou,ZHAO Zhenxia,et al

(DepartmentofBurn,TheSecondRenminHospital,Liaocheng,Shandong252600,China)

ObjectiveTo investigate the impact of basic fibroblast growth factor(bFGF) and hypoxia-induced factor -1(HIF-1) mediated by nanoparticleon hypoxia tolerance of random skinflap in rats.MethodsWe designedone random skin flap of 6cm×2cm on the back of SD rat(n=40).Then rats were randomized into four groups:group A as the experimental group with application of bFGF and HIF-1;group Bas the first control group with soleapplication ofbFGF;group C as the second control group with sole application of HIF-1 and group D as blank control group with application of normal saline only.ResultsThe exprimental group which was mediated bynanoparticle,compared with the other control groups,achieved higher survival rate of skin flap.ConclusionsGene therapy with bFGF and HIF-1 mediated by nanoparticle can promote the neovascularization in skinflap,enhance the hypoxia tolerance and increase the survival rate of random skin flap of rats.

Surgical flaps；Nanocapsules；Fibroblast growth factors；Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator；Neovascularization,physiologic；Rats

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.008

2016-03-18，

2016-06-21)