不同熒光定量PCR技術在乙型肝炎病毒檢測中的應用評價

朱明巖，葉英

(安徽醫科大學第一附屬醫院感染病科，安徽 合肥　230022)

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不同熒光定量PCR技術在乙型肝炎病毒檢測中的應用評價

朱明巖，葉英

(安徽醫科大學第一附屬醫院感染病科，安徽 合肥230022)

目的評價普通熒光定量PCR技術與羅氏內標法熒光定量PCR技術在乙型肝炎病毒(HBV)檢測中的意義。方法采集HBV患者的血清190份，分別用兩種方法進行檢測，通過相關性分析和Kappa檢驗評價兩種試劑檢測結果之間的差異性及一致性。結果(1)190份標本中，羅氏Cobas試劑與國產試劑檢測結果呈線性相關(R2=0.670 7，P<0.05)；(2)分成HBeAg(+)與HBeAg(-)兩組比較，兩組中Cobas試劑與國產試劑檢測均呈線性相關(R2=0.586 4，P<0.05；R2=0.522 6，P<0.05)；(3)根據不同HBeAg狀態和抗病毒要求的DNA載量對標本進行一致性分析，HBeAg(+)組Kappa值為0.752；HBeAg(-)組Kappa值為0.381。結論對于HBeAg(+)患者，可以應用國產試劑檢測患者的HBV-DNA水平，而對于HBeAg(-)患者，建議應用Cobas試劑檢測其患者的HBV-DNA水平。

乙型肝炎病毒;多重聚合酶鏈式反應;熒光抗體技術

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是世界性公共衛生問題，全世界約有2.48億慢性HBV感染者[1-4]。慢性HBV感染病情進展可發展為肝硬化、肝癌，危及患者生命[5]。乙型肝炎病毒基因(Hepatitis B Virus gene,HBV DNA)載量在評價治療指征、治療效果及耐藥的發生方面具有非常重要的價值。羅氏內標法Cobas檢測是國際上公認的標準，然而試劑價格昂貴，在我國難以廣泛使用。目前我國已批準實時熒光定量PCR試劑用于HBV DNA檢測，但與羅氏Cobas檢測在結果上的差異尚不明確。因此，本研究對HBV感染者包括正在使用抗病毒治療的患者，進行了羅氏Cobas試劑和國產試劑的HBV DNA同步檢測，以了解兩者的差異和一致性，以便在臨床中更加合理地應用國產試劑和羅氏Cobas試劑。

1　材料與方法

1.1標本來源收集2014年3～12月安徽醫科大學第一附屬醫院收治的乙肝病毒感染者的血清標本190份。男138例，女52例，年齡10～72歲。所有患者均符合中國2010版“慢性乙型肝炎防治指南”的慢性HBV感染的診斷標準[6]。標本均系空腹采取，2 h內分離血清并置于-20 ℃低溫冰箱保存。

1.2檢測方法

1.2.1HBV-DNA檢測采用羅氏內標法熒光定量

PCR試劑對190份標本進行檢測，其配套儀器為Roche CobasTaqMan 48 PCR儀，檢測的線性范圍為2 IU·L-1～1.7×108IU·L-1；采用國產熒光定量PCR試劑(上海之江生物科技公司生產)對190份標本進行檢測，其配套儀器為Applied Biosystem公司生產的ABI 7500基因擴增儀，其檢測下線為5.0×102IU·L-1。操作和結果判定均參照試劑盒說明書進行。試劑均有正式批文，批檢合格并在有效期內使用。

1.2.2HBV血清標志物檢測

采用酶聯免疫吸附法，試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司。操作和結果判定均參照試劑盒說明書進行，所有試劑均有正式批文，批檢合格并在有效期內使用。

1.3統計學方法采用SPSS 16.0進行統計學分析。一致性檢驗采用Kappa檢驗進行分析，回歸方程采用雙變量的線性回歸，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩種檢測方法的定量結果

2.1.1羅氏Cobas試劑檢測結果

190例標本中處于Cobas試劑檢測下限(數值為≤2 IU·L-1)的有10例，大于Cobas檢測上限(數值為≥1.7×108IU·L-1)的標本有7份，余下的173份均檢測出具體數量，分別在102≤DNA<103，103≤DNA<104，104≤DNA<105，105≤DNA<106，106≤DNA<107，107≤DNA<1.7×108(IU·L-1)范圍內的標本數分別為：29，55，37，14，19，19。

2.1.2國產試劑檢測結果

190例標本中處于國產試劑檢測下限(數值為<5×102IU·L-1)的有72例，余下118份均檢測出具體載量，分別在102≤DNA<103，103≤DNA<104，104≤DNA<105，105≤DNA<106，106≤DNA<107，DNA ≥107(IU·L-1)范圍內的標本數分別為：8，38，18，17，16，21份。

2.2HBV血清標志物檢測結果190例標本中HBsAg(+)、HBeAg(+) 98例，HBsAg(+)、HBeAg(-) 92例。

2.3兩種檢測方法的相關性分析

2.3.1HBV DNA定量結果相關性

所有結果經對數轉換后進行相關性分析(注：總標本為190份，排除低于國產試劑檢測下限者72份和高于羅氏Cobas檢測上限者7份，可進行相關性分析標本為111份)，見圖1，表明國產試劑與羅氏試劑檢測結果呈線性相關。

圖1　羅氏Cobas試劑與國產試劑檢測結果的相關性分析(n=111，P< 0.05)

2.3.2不同乙型肝炎E抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)狀態兩種試劑檢測結果相關性

111例患者樣本分為HBeAg(+)組61例和HBeAg(-)組50例，HBV DNA結果分別取對數值后進行相關性分析(圖2、3)，表明兩組均呈線性相關。根據兩組R2值水平，HBeAg(+)組兩種試劑檢測結果相關性較高。

2.3.3不同HBV DNA載量兩種試劑檢測結果相關性

根據國產試劑檢測結果，剔除190例標本中處于檢測下限的72例，余下118例按不同載量分為6個區段：500≤DNA<103，103≤DNA<104，104≤DNA<105，105≤DNA<106，106≤DNA<107，DNA ≥107(IU·L-1)，其與羅氏Cobas定量結果的相關性r數值分別為：-0.292,0.478,-0.240,0.283,0.311,0.891，P值分別為：0.484,0.002,0.336,0.271,0.242,0.000。可見國產試劑與羅氏Cobas試劑僅在103≤DNA<104和DNA ≥107(IU·L-1) 這兩個區段相關性較好，其余的載量區段無相關性。

圖2　HBeAg(-)組羅氏Cobas試劑與國產試劑檢測結果相關性分析(n=50, P<0.05)

圖3　HBeAg(+)組羅氏Cobas試劑與國產試劑檢測結果相關性分析(n=61,P<0.05)

2.3.4根據HBeAg狀態和HBV DNA載量分層分析

將190份標本根據不同HBeAg狀態和抗病毒要求的DNA載量進行分層，當HBeAg(+)且HBV DNA<2×104IU·L-1時，采用國產試劑檢測，符合的標本有45例；采用羅氏Cobas試劑檢測結果分別為：HBV DNA<2×104IU·L-1的有37例，占82.2%；HBV DNA≥2×104IU·L-1有8例，占17.8%。HBeAg(-)且HBV DNA<2×103IU·L-1時，采用國產試劑檢測，符合的標本有57例，采用羅氏Cobas檢測結果分別為：HBV DNA<2×103IU·L-1的有24例，占42.1%，HBV DNA≥2×103IU·L-1有33例，占57.9%(圖4)。

圖4　不同HBeAg狀態和不同DNA載量羅氏檢測結果

2.4根據不同HBeAg狀態和抗病毒要求的DNA載量對總標本進行一致性分析HBeAg(+)組98例，根據抗病毒要求將HBV DNA≥2×104IU·L-1，設為檢測結果陽性，而HBV-DNA<2×104IU·L-1設為陰性；其Kappa值為0.752，說明國產試劑檢測與CobasTaqMan試劑檢測一致性較高；HBeAg(-)組92例，將HBV-DNA≥2×103IU·L-1，設為檢測結果陽性，而HBV DNA<2×103IU·L-1設為陰性；其Kappa值為0.381，其檢測值<0.4，說明國產試劑檢測與CobasTaqMan試劑檢測一致性較差。如圖5。

圖5　兩種檢驗結果一致性比較

3　討論

本研究結果顯示國產試劑與羅氏Cobas試劑具有較好的相關性，并呈線性相關(R2=0.6707，P<0.05)，表明國產試劑檢測結果總體上反映血清中HBV DNA水平[1-2]；將結果按不同HBV DNA水平進行分組分析，發現國產試劑僅在病毒載量在103≤DNA<104和107≤DNA<1.7×108(IU·L-1) 范圍的標本與羅氏檢測具有較好的相關性，而載量在104≤ DNA <107IU·L-1范圍內的標本相關性相對較差，這與薛艷等[7]報道相似。

根據不同HBeAg狀態和抗病毒要求的DNA載量對總標本進行分層分析，HBeAg(+)組：國產試劑和羅氏Cobas試劑檢測結果具有良好的相關性和一致性，按國產試劑檢測結果顯示HBV DNA<2×104IU·L-1的45例患者，應用Cobas試劑檢測有8例達到HBV-DNA≥2×104IU·L-1，占17.8%，可見對于HBeAg(+)患者，國產試劑可以基本反應體內病毒載量情況，但若經濟條件許可，仍然建議羅氏檢測尤其對于已使用核苷類藥物治療超過6月的患者。HBeAg(-)組：國產試劑和羅氏Cobas試劑檢測結果雖呈線性相關，但其一致性差，經國產試劑檢測的不需抗病毒治療的57例患者，應用Cobas試劑檢測HBV DNA≥2×103IU·L-1有33例，占57.9%，因此對于HBeAg(-)低病毒載量的患者，建議應用Cobas試劑檢測。對HBeAg(-)患者若僅根據國產試劑檢測結果，不采取抗病毒治療措施，可能會使病情進展為肝硬化或肝癌，而延誤了患者的診治。與羅氏Cobas試劑相比，國產試劑的靈敏度及檢測范圍仍有一定差距，分析原因主要包括：(1)PCR引物不夠保守，標本存在HBV基因突變時導致擴增不能。(2)國產試劑熒光探針結合區基因序列可以出現突變，引起探針不能夠有效地與擴增的靶基因結合，最終無法顯示擴增的量[8-9]。羅氏Cobas系統有以下特性[10-12]：(1)在引物設計上覆蓋了HBV A-G亞型，而且避開了常見的突變位點，如YMDD突變區、前C區和核心啟動子變異區，在歐美有12%～27%的CHB患者HBV DNA基因存在前C區突變，而在亞太地區前C區的突變率高達47%～60%。(2)設立內部標準品的管內質控，與國產試劑采用的外標法定量相比，內標法完全消除由于核酸提取、擴增效率不同而造成的管間差異。

對于慢性HBV攜帶者，抗病毒治療是關鍵，需要把握好抗病毒治療指征。若延遲抗病毒治療，可使病情進展。因此對于HBV攜帶者應定期檢測肝功能、B超等，尤其HBV-DNA至關重要。HBeAg(+)慢性HBV感染者，多處于免疫耐受期，此期HBV-DNA水平高，然并無明顯肝臟損害，暫無需抗病毒治療，但需定期監測肝功能、HBV-DNA等變化，把握治療時機，綜合經濟因素，可用國產試劑代替羅氏試劑應用于定期檢測。對于HBeAg(-)慢性HBV感染者，HBV-DNA常處于不復制或低水平復制狀態，但此期患者亦可隱匿進展為肝硬化、肝癌，根據本研究應積極采用羅氏Cobas試劑定期監測DNA；正如徐啟恒等報道[13]，對于肝硬化患者，其病情程度與血清HBV DNA高水平并沒有顯著相關性，往往呈現低病毒載量，尤其是HBeAg(-)肝硬化患者。

綜合以上，對于HBeAg(-)患者尤其肝硬化患者，建議積極應用羅氏Cobas試劑進行定期檢測；對于接受抗病毒治療的慢乙肝患者，定期監測HBV-DNA特別在關鍵時間點如第12周、24周、48周時，可評估抗病毒藥物療效及耐藥風險，應積極采用羅氏Cobas進行檢測或復測，避免假陰性結果而延誤病情，從而讓患者得到更有效、更有價值的治療，提高肝炎患者的治療效果和生活質量。

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Application evaluationof different PCR technologies in detecting HBV-DNA

ZHU Mingyan,YE Ying

(DepartmentofEpidemiology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230022,China)

ObjectiveTo evaluate the application of domestic PCR technology and Cobas Ampli Prep/CobasTaqMan 48 PCR technology in detecting HBV-DNA.MethodsWecollected 190 serum samples from patients with chronic HBV infections in The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University and the samples were monitored by domestic reagent and CobasTaqMan reagent.The performances of the two reagents were compared and analyzed by correlation analysis and Kappa test.ResultsThe 190 serum samples were tested by two assays and there wassignificant linear correlation betweenthe two methods(R2=0.670 7,P<0.05).The serum samples were assigned into HBeAg-positive and HBeAg-negative groups.The data of two test methods had significantlinear correlation(R2=0.586 4，P<0.05；R2=0.522 6，P<0.05).The conformity analysis showed that the Kappa values were 0.752 in HBeAg-postive group and 0.381 in HBeAg-negative group.ConclusionsThe results of two test methods had poor conformity.CobasTaqMan reagent can be used to monitor HBV-DNA quantities in HBeAg-negative patients while domestic reagent canbe used in HBeAg-positive group.

Hepatitis B virus;Multiplex polymerase chain reaction;Fluorescent antibody technique

國家自然科學基金資助項目(81172737)

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.031

2016-03-04，

2016-06-28)