薯蕷丸抗I型變態反應作用及其機理研究

黃騰煒，洪 蕾

（1.重慶醫科大學中醫藥學院2013級碩士研究生，重慶 400016；

2.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016）

薯蕷丸抗I型變態反應作用及其機理研究

黃騰煒1，洪 蕾2

（1.重慶醫科大學中醫藥學院2013級碩士研究生，重慶 400016；

2.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016）

目的：探討薯蕷丸抗I型變態反應作用及其機制。方法：以卵白蛋白為變應原制備大鼠I型變態反應模型，制備抗卵白蛋白的抗血清（含IgE），采用大鼠同種被動皮膚過敏反應（PCA）實驗法觀察測定各組動物藍斑直徑、藍斑光密度（OD）及藍斑抑制率；以抗卵白蛋白血清被動致敏的大鼠顱骨肥大細胞模型觀察對肥大細胞脫顆粒的影響；通過Elisa法檢測I型變態反應模型大鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE含量變化的影響。結果：薯蕷丸蜜丸可明顯抑制大鼠同種PCA反應，降低Ⅰ型變態反應模型大鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE含量。結論：薯蕷丸蜜丸有抗Ⅰ型變態反應的作用，其機制可能是通過促進IFN-γ分泌、降低IL-4及IgE含量、調節Th1/Th2細胞因子水平完成的。

薯蕷丸；I型變態反應；IL-4；IFN-γ

蕁麻疹是皮膚科臨床常見的I型變態反應性疾病，是由于皮膚、黏膜小血管擴張及滲透性增加而出現的一種局限性水腫反應，主要表現為風團反復發作，伴隨劇烈瘙癢等。病情頑固，遷延不愈，因其發病涉及到多種的介質和細胞，病因及病理機制非常復雜，我們觀察薯蕷丸治療慢性蕁麻疹臨床療效及其安全性，結果發現薯蕷丸治療圍絕經期女性慢性蕁麻疹療效好，復發率低，不良反應少［1］。現將薯蕷丸抗I型變態反應作用及其機理研究總結如下。

1　材 料

1.1實驗動物

健康SD大鼠，雌雄各半，體質量180～220g，由重慶醫科大學實驗動物房提供。大鼠在SPF實驗環境中適應性常規喂養5天。

1.2實驗藥物與試劑

薯蕷丸蜜丸（重慶桐君閣中藥材市場加工）［2］，氯苯那敏片（廣東南國藥業有限公司，批號120803），卵白蛋白（SIGMA公司生產，重慶鴻兵生物技術有限公司進口分裝，批號201412），百白破疫苗（成都生物制品研究所提供，批號20120421-1），伊文思藍（BBI公司生產，重慶鴻兵生物技術有限公司進口分裝，批號201507），中性紅（SIGMA公司生產，重慶鼎國生物有限公司進口分裝，批號201204626215）IL-4、IFN-γ、IgE酶聯免疫法檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。

薯蕷丸由山藥、當歸、桂枝、神曲、干地黃、豆黃卷、甘草、人參、川芎、芍藥、白術、麥門冬、杏仁、柴胡、桔梗、茯苓、阿膠、干姜、白蘞、防風、大棗組成，藥材均購于重慶市桐君閣中藥材加工專業市場，經重慶醫科大學中醫藥研究室鑒定為正品藥材。藥材按《金匱要略》記載的比例配伍后通過適當粉碎，取3倍量水浸泡約0.5h后武火煮沸，文火煎煮20min，通過2次煎煮，將2次所得濾液合并，盛放并靜置，取上清液水煎后進行濃縮提取，濾液濃縮至原生藥含量3.2g/mL，置于4℃冰箱低溫備用。每次制備2日用藥量，濃縮后2天內用完，臨時用蒸餾水稀釋。

據《藥理實驗方法學》“不同動物等效劑量折算系數表”將成人（70kg）每日所需用藥量換算成大鼠（kg）所需藥量，并以此劑量設為實驗中劑量。計算公式為D大鼠=K·D人。D大鼠為200g大鼠每日所需藥量，K為折算系數，人與大鼠間的折算系數為0.018，D人為70kg成人每日所需藥量。薯蕷丸低、中、高劑量組給藥比例設置為1∶2∶4。低劑量組給予經方薯蕷丸濃縮水煎劑15.25g/（kg·d），中劑量組給予經方薯蕷丸濃縮水煎劑30.5g/（kg·d），高劑量組給予經方薯蕷丸濃縮水煎劑61g/（kg·d）。

1.3實驗主要儀器

80-2型低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），721B型分光光度計（上海第三分析儀器廠），Sartorius微量天平，生物顯微鏡（OLYMPUS）。

2　方 法

2.1薯蕷丸對大鼠同種被動皮膚過敏試驗（PCA）反應的影響

抗卵白蛋白血清的制備：取大鼠6只，將1%卵白蛋白生理鹽水溶液按0.5mL，肌內注射于后腿兩內側，同時每只腹腔注射百白破疫苗0.2mL，第13天（IgE高峰期）將動物用乙醚麻醉后，腹主動脈取血，2000r/min離心10min，分離取得卵白蛋白抗IgE血清，置冰箱備用。

被動皮膚致敏：取大鼠60只，稱重，按體質量隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，即正常對照組、模型組、氯苯那敏組（0.17mg/kg），薯蕷丸蜜丸低劑量組（15.25g/kg）、薯蕷丸蜜丸中劑量組（30.5g/kg）、薯蕷丸蜜丸高劑量組（61g/kg）。正常對照組和模型對照組灌服生理鹽水，其余組分別予以灌服相應藥物的生理鹽水溶液。于分組給藥后的第6天用乙醚淺麻醉，在大鼠背中線兩側，距脊柱1.5cm處，將毛剪光，每側取2個點，兩點間隔2cm，左右側分別皮內注射1∶5，1∶10稀釋的含IgE抗血清0.1mL。48h后進行抗原攻擊，尾靜脈注射0.5%伊文思藍溶液1mL，內含卵白蛋白1mg。經30min后剪下背部皮膚，檢測注射各點的藍色反應斑直徑，隨后剪下藍色皮膚斑，剪碎置5mL丙酮生理鹽水混合溶液中（7∶3）浸泡48h，2000r/min離心，取上清液，在610nm波長處測定吸光度（OD值）。

抑制百分率=（1-給藥組平均吸光度值/模型組平均吸光度值）×100%

2.2薯蕷丸對大鼠顱骨骨膜肥大細胞脫顆粒試驗的影響

IgE血清制備：與抗卵白蛋白血清的制備相同。取大鼠60只，稱重，按體質量隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，即正常對照組、模型組、氯苯那敏組（0.17mg/ kg），薯蕷丸蜜丸低劑量組（15.25g/kg）、薯蕷丸蜜丸中劑量組（30.5g/kg）、薯蕷丸蜜丸高劑量組（61g/ kg）。正常對照組和模型對照組灌服生理鹽水，其余組分別予以灌服相應藥物的生理鹽水溶液。于分組給藥后的第6天，各組動物每只頭部皮下注射1∶20稀釋的含IgE血清0.1mL。致敏后48h，尾靜脈注射1%卵白蛋白生理鹽水溶液和1%伊文思藍各1mL，經30min后處死動物。切開頭部皮膚剝離剪下顱骨，置于95%乙醇中1h后取出，放入無水甲醇中過夜。然后以0.18%中性紅酒精溶液染色30min，用水沖洗后剝離顱骨骨膜，展開鋪于載玻片上，干燥，加蓋玻片，封固置于顯微鏡高倍鏡下觀察。每張切片隨機選取不重復視野，細胞邊緣光滑、胞內顆粒分布均勻的為正常肥大細胞，胞膜破裂、顆粒溢出的為脫顆粒肥大細胞。按以下公式計算肥大細胞脫顆粒率和脫顆粒抑制率。

肥大細胞脫顆粒率（%）=脫顆粒肥大細胞數/肥大細胞總數×100%

肥大細胞脫顆粒抑制率抑制率（%）=（1-給藥組肥大細胞脫顆粒率/模型組肥大細胞脫顆粒率）×100%

2.3薯蕷丸對大鼠血清IL-4、IFN-γ、IgE含量變化的影響

大鼠60只，稱重，按體質量隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，即正常對照組、模型組、氯苯那敏組（0.17mg/kg），薯蕷丸蜜丸低劑量組（15.25g/kg）、薯蕷丸蜜丸中劑量組（30.5g/kg）、薯蕷丸蜜丸高劑量組（61g/kg）。正常對照組和模型對照組灌服生理鹽水，其余組分別予以灌服相應藥物的生理鹽水溶液。以生理鹽水配制氫氧化鋁懸液（10mg/mL），正常對照組大鼠腹腔注射1mL/只，其余各組大鼠腹腔注射卵白蛋白（lmg）與氫氧化鋁懸液（1mL）的混合液進行初次免疫，第10天重復1次。初次免疫后第6天，灌胃給藥。其中正常對照組給予等量生理鹽水，日1次，持續9日。末次給藥2h后，大鼠腹主動脈取血，2000r/ min離心10min，取血清，分裝，-20℃保存。采用大鼠IL-4、IFN-γ、IgE酶聯免疫試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作，分別測定血清中IL-4、IFN-γ、IgE的吸光度，根據標準曲線，計算濃度，并比較IFN-γ/IL-4值的變化。

2.4統計學方法

3　結 果

薯蕷丸對大鼠同種被動皮膚過敏試驗（PCA）反應的影響見表1。

表1　薯蕷丸對大鼠同種被動皮膚過敏（PCA）反應的影響 （±s）

表1　薯蕷丸對大鼠同種被動皮膚過敏（PCA）反應的影響 （±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01，○P＜0.05。

組別nOD值抑制率（%）1∶51∶101∶51∶10正常對照組100.018±0.010.015±0.011模型組100.878±0.270*0.456±0.191*氯苯那敏組100.302±0.104#0.195±0.133#（65.60）（57.24）薯蕷丸蜜丸低劑量組100.569±0.115#0.301±0.147（35.19）（33.99）薯蕷丸蜜丸中劑量組100.421±0.175#0.251±0.116○（52.05）（44.96）薯蕷丸蜜丸高劑量組100.316±0.109#0.191±0.109#（64.01）（58.11）

薯蕷丸對大鼠顱骨骨膜肥大細胞脫顆粒試驗的影響見表2。

表2　薯蕷丸對大鼠顱骨骨膜肥大細胞脫顆粒試驗的影響 （±s）

表2　薯蕷丸對大鼠顱骨骨膜肥大細胞脫顆粒試驗的影響 （±s）

注：與模型組比較，#P＜0.01；與正常對照組比較，*P＜0.01。

組別n肥大細胞脫顆粒抑制率（%）正常對照組1010±3.18模型組1067±7.58*氯苯那敏組1032±6.55#（52.24）薯蕷丸蜜丸低劑量組1055±6.32#（17.91）薯蕷丸蜜丸中劑量組1044±7.02#（34.33）薯蕷丸蜜丸高劑量組1035±5.38#（47.76）

薯蕷丸對大鼠血清IL-4、IFN-γ含量的影響見表3。

表3　薯蕷丸對大鼠血清IFN-γ、IL-4含量的影響 （pg/mL，±s）

表3　薯蕷丸對大鼠血清IFN-γ、IL-4含量的影響 （pg/mL，±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01，○P＜0.05。

組別nIFN-γIL-4IFN-γ/IL-4正常對照組1049.72±7.1220.02±5.112.48±0.59模型組1037.60±6.34*30.01±6.45*1.25±0.38氯苯那敏組1048.87±7.56#22.33±4.23#2.19±0.79#薯蕷丸蜜丸低劑量組1040.32±6.7526.31±5.571.53±0.31薯蕷丸蜜丸中劑量組1045.68±7.69○24.12±6.06○1.89±0.57#薯蕷丸蜜丸高劑量組1049.02±8.19#20.97±5.35#2.34±0.53#

薯蕷丸對大鼠血清IgE含量的影響見表4。

表4　薯蕷丸對大鼠血清IgE含量的影響 （Iu/mL，±s）

表4　薯蕷丸對大鼠血清IgE含量的影響 （Iu/mL，±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01，○P＜0.05。

組別nIgE正常對照組1012.66±3.14模型組1034.55±6.21*氯苯那敏組1015.39±3.90#薯蕷丸蜜丸低劑量組1028.77±5.930薯蕷丸蜜丸中劑量組1025.22±4.18#薯蕷丸蜜丸高劑量組1016.34±5.56#

4　討 論

I型變態反應性疾病發病的兩個主要階段即致敏階段和發敏階段，體內特異性IgE含量升高在致敏階段發揮著重要作用，而肥大細胞脫顆粒在發敏階段發揮著重要作用。其發病機制是因為抗原進入機體以后，刺激B細胞轉化為漿細胞產生IgE抗體，其與嗜堿性粒細胞或肥大細胞表面的IgE受體結合后，機體處于致敏狀態。當機體再次接觸到致敏原時，便與吸附在靶細胞膜表面的IgE抗體結合，引起靶細胞發生一系列酶反應，導致過敏介質的釋放、血管通透性增加以及毛細血管擴張等反應，最終出現機體過敏癥狀。T輔助淋巴細胞（Th細胞）分泌的細胞因子對I型變態反應中IgE抗體的合成起著重要的調節作用。Th細胞根據自身所分泌的細胞因子，主要分為Th1和Th2兩個亞群。Th1細胞分泌的細胞因子包括IL-2、IFN-γ、TNF-β等，主要參與細胞免疫應答過程；Th2細胞分泌的細胞因子包括IL-4、IL-10等，主要參與體液免疫應答過程。白介素-4（IL-4）作為B細胞的旁分泌生長因子，可刺激B細胞，促進IgE抗體的合成；而干擾素γ（IFN-γ）可抑制細胞合成IL-4。在一定程度上抑制IgE的產生是從根本上預防I型變態反應性疾病發生的關鍵所在，而細胞因子IL-4和IFN-γ比例的失衡是導致IgE分泌異常的重要原因之一。因此，調節細胞因子IL-4和IFN-γ的分泌及比例，可起到抗I型變態反應的作用［3-5］。

目前臨床治療I型變態反應性疾病多采用激素類藥物和抗組胺類藥物，控制過敏癥狀的發生，所以通常療效短暫且易反復發作。而薯蕷丸治療的特色便在于可標本兼治，具有抗過敏和調節免疫的作用［6］。遵循《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治第六》“虛勞諸不足，風氣百疾，薯蕷丸主之”，其主治虛勞諸不足，抗病力薄弱，被外邪侵襲所致的虛損兼夾外邪之證，認為“風氣百疾”均在薯蕷丸的治療范圍以內。藥理研究證實其可調節細胞免疫與體液免疫功能，提高機體免疫力［7］，刺激紅細胞、白細胞生成［8］。薯蕷丸方中所含多種藥物經藥理研究證實有改善免疫功能的作用，如薯蕷可直接作用于小鼠免疫反應早期階段，使全身淋巴器官的發育和機體免疫力加強，能增強機體的細胞免疫功能和體液免疫功能，對機體免疫力有改善作用；所含四君子湯能促進T細胞分泌集落刺激因子，提高機體免疫功能［9］；所含四物湯可促進ConA誘導的淋巴細胞增殖，增加T細胞功能，具有免疫激活作用，對體液免疫和細胞免疫也均有顯著增強作用［10-12］，使HSP70及其抗體表達更進一步加強，抵抗應激免疫抑制［13-14］。因此，可以從一個方面證實薯蕷丸確實能提高機體抵抗力，抵御風邪的侵襲，減少疾病的發作。

研究結果表明，薯蕷丸可抑制大鼠同種被動皮膚過敏反應，使致敏處皮膚毛細血管通透性降低，吸光度值下降。薯蕷丸對抗體介導的大鼠肥大細胞脫顆粒具有抑制作用，并能夠使致敏大鼠血清中細胞因子IL-4含量減少、IFN-γ含量增加、IFN-γ/IL-4比值升高、IgE抗體的含量減少。實驗結果還表明薯蕷丸低、中、高劑量的量效關系明顯，且高劑量效果良好。

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Objective：To study the effect and the mechanism of Shuyu Pills on anti type I allergic reaction. Method: Taking ovalbumin as allergen to prepare type I allergic reaction rat models and to prepare anti- ovalbumin antiserum containing IgE， we adoptedpassive cutaneous anaphylaxis （PCA）reactionexperimental method to observe and detect the diameters， the optical density （OD） and the inhibition rate of the locus coeruleus in each group， applied pericranium mast cell in model rats sensitized by anti- ovalbumin serum to observe the effect on mast cell degranulation and used Elisa method to detect the effect on the changes of content of IL-4， IFN-γ and IgE in serum of type I allergic reaction model rats. Result: Shuyu Honey Pills could significantly inhibit homologous PCA reaction and decrease the content of IL-4 and IgE in serum of type I allergic reaction model rats. Conclusion: Shuyu Honey Pills have the effect of anti type I allergic reaction. The possible mechanism is that Shuyu Honey Pills could regulate Th1/Th2 cytokine level through improving the secretion of IFN-γ and decreasing the content of IL-4 and IgE.

Shuyu Pills；Type I allergic reaction；IL-4；IFN-γ

R285.6

B

1004-2814（2016）09-0852-03

2016-05-04