石墨烯量子點熒光探針測定腎上腺色腙

馬紅燕,王艷妮

（延安大學化學與化工學院陜西省反應工程重點實驗室，陜西延安 716000）

石墨烯量子點熒光探針測定腎上腺色腙

馬紅燕*,王艷妮

（延安大學化學與化工學院陜西省反應工程重點實驗室，陜西延安 716000）

通過高溫裂解檸檬酸合成了水溶性石墨烯量子點（GQDs），并應用鈍化劑PEG2000進行修飾，提高了GQDs的量子產率。應用熒光光譜、紫外-可見光譜、紅外光譜對其發光特性進行了研究，測定了熒光壽命。實驗發現，在PH＝7.40的Tris-HCl緩沖液中，腎上腺色腙（CBZC）對GQDs熒光強度有明顯的猝滅作用。基于此提出了以GQDs為探針測定腎上腺色腙的新方法。實驗考察了緩沖溶液用量、緩沖溶液種類、量子點濃度、反應時間以及表面活性劑等多種因素對反應體系的影響。當量子點濃度為2.3×10-3mol/L時，腎上腺色腙濃度在4.0×10-7～1.2×10-5mol/L（0.995 6）范圍內與熒光猝滅值ΔF呈良好的線性關系，方法檢出限為1.5×10-7mol/L，相對標準偏差為0.15%（n＝5，c＝4.0×10-6mol/L）。該方法對于樣品中腎上腺色腙含量測定的回收率為97.46%～101.6%。通過測定溫度對猝滅常數的影響以及紫外-可見吸收光譜的變化確定了二者的猝滅過程和相互作用力類型。

石墨烯量子點（GQDs）;熒光探針;腎上腺色腙（CBZC）;檸檬酸

1　引 言

近年來，碳納米發光材料的低毒性和強熒光性質受到了越來越密切的關注[1-2]。石墨烯量子點作為碳量子點的一種，一般尺寸小于10 nm，因此比一維的石墨烯量子帶和二維的石墨烯量子片表現出更強的量子限域效應和邊界效應[3]，在生物、醫藥和材料等方面展現出更加誘人的應用前景[4-5]。石墨烯量子點的合成方法研究頗多，如電化學氧化法[6]、機械剝離法、氧化石墨還原法、化學氣相沉淀法、電弧法[7]、有機合成等。目前量子點在金屬離子的識別和檢測領域研究較多，但在藥物分子分析領域的研究還很少。

腎上腺色腙又稱安絡血或卡巴克絡（Carbazochrome，CBZC），臨床主要用于腦、肺、腎、腸毛細管損傷出血及血小板減少癥狀[8]。目前腎上腺色腙的測定方法主要有近紅外光譜法[9]、分光光度法[10]、高效液相色譜法[11]、化學發光法[12]及熒光分析方法[13]等。

本文采用自上而下的方法高溫裂解檸檬酸合成了具有優良熒光特性的GQDs，并對其進行修飾，發現GQDs發出很強的藍色熒光。腎上腺色腙對GQDs熒光強度有明顯的猝滅作用，據此建立了一種測定腎上腺色腙的新方法，并對其作用機理進行了研究。

2　實 驗

2.1儀器及試劑

2.1.1儀器

F-4500型熒光分光光度計（日本日立公司）; 8453型紫外-可見分光光度計（美國安捷倫公司）;FLSP920瞬態穩態熒光光譜儀（英國愛丁堡公司）;IR Prestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀（日本Shimaozu公司）。

2.1.2試劑

濃度為1.0×10-3mol/L CBZC標準溶液;濃度為10 mg/mL的NaOH溶液;Tris-HCl緩沖液（PH＝7.40）;檸檬酸。所用試劑均為分析純，水為UP超純水。

CBZC標準溶液的配制:準確稱取腎上腺色腙標準品（中國藥品生物制品檢定所）0.023 6 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，放置冰箱中待用。

2.2實驗方法

2.2.1GQDs的合成

在文獻[1]的基礎上，另外引入了PEG進行修飾，采用自上而下的方法裂解檸檬酸合成GQDs。具體方法為:準確稱取1.000 0 g檸檬酸和0.500 0 g PEG2000放入小燒杯中，用電熱套直接加熱，檸檬酸開始裂解。5 min后，檸檬酸熔解為無色液體;繼續加熱，溶液由無色變為亮黃色。將溶液轉移到30.00 mL的NaOH溶液中（10 mg/ mL），連續攪拌，反應完全后轉移、稀釋至250 mL容量瓶中，放置在冰箱里待用。GQDs的濃度以檸檬酸的量計算。該合成方法具有簡單、快速的優點。

2.2.2熒光光譜圖的測定

移取3.00 mL GQDs于25 mL比色管中，加入3.00 mLTris-HCl緩沖溶液，再加入適量腎上腺色腙溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。室溫下反應20 min后，于F-4500型熒光分光光度計測定熒光光譜圖，測定體系熒光強度（F）和試劑空白（F0），計算ΔF和CBZC濃度之間的關系。激發波長和發射波長為λex/λem＝367/462 nm，狹縫寬度均為5 nm。

3　結果與討論

3.1GQDs的特性

3.1.1GQDs的熒光光譜、紫外-可見吸收光譜和熒光壽命

圖1為GQDs的熒光光譜和紫外-可見吸收譜。從圖中可看出修飾前后量子點的最大吸收波長并無變化。在462 nm處出現最大熒光發射峰，與文獻報道的GQDs的熒光特性也相吻合;但修飾后的量子點熒光強度明顯增大，熒光量子產率增加，且發射峰的半峰寬較窄，說明該量子點單一、均勻。

圖1　GQDs的熒光光譜和紫外-可見吸收光譜Fig.1　Fluorescence spectra and UV-Vis absorPtion of GQDs

我們于FLSP920瞬態穩態熒光光譜儀上測定了該GQDs的熒光衰減曲線，擬合結果如圖2所示。根據加權平均計算法[14]，得出GQDs的熒光壽命為1.87 ns，熒光壽命較短，據推測可能是激子（電子與空穴對）的重組合發光[15]。χ2接近于1，說明實驗數據在可信范圍內。

圖2　GQDs的熒光衰減曲線Fig.2　Flourescence decaY curves of GQDs

3.1.2GQDs的結構表征

量子點的光致發光是其非常重要的特性之一。量子點具有寬而連續的激發譜，可實現一元激發和多元激發，為實現生物分子的多組分同時檢測提供了可能。目前很多實驗發現，量子點的發射峰強度和位置與激發波長有關。本實驗于F-4500型熒光分光光度計上檢測不同激發波長下的GQDs熒光強度，所有測試均在298 K下進行。改變激發波長，發射峰位置和強度也隨之發生變化，如圖3所示。當激發波長由340 nm增加到400 nm時，發射波長由444 nm紅移至488 nm，同時熒光強度先增大后減小。當激發波長為367 nm時，熒光強度達到最大。

圖3　GQDs在不同激發波長下的熒光光譜Fig.3　Fluorescence spectra of GQDs with different excitation wavelengths

圖4為GQDs的紅外光譜圖:1 399 cm-1和1 578 cm-1處檢測到有強的吸收峰，分別為—COO-的對稱伸縮振動和反對稱伸縮振動; 1 725 cm-1為—C＝O的特征吸收峰;2 914 cm-1附近有兩個強度很弱的雙峰，可能為C—H的對稱與反對稱伸縮振動吸收峰;3 433 cm-1為—OH的伸縮振動峰。根據分析得知該量子點含有羧基和羥基，所以有很好的親水性[16]。

圖4　GQDs的傅里葉變換紅外光譜Fig.4　FTIR spectra of GQDs

3.1.3不同酸度對量子點熒光強度的影響

溶液的酸度對量子點的發光強度有一定影響，因此，本實驗研究了GQDs在不同酸度下的熒光強度及穩定性。在酸性介質中，其熒光強度小;在中性和堿性條件下，GQDs的熒光強度明顯增大，且不隨PH的變化而變化，表明GQDs在中性和堿性條件下熒光穩定。

3.2腎上腺色腙的測定

3.2.1熒光光譜圖

室溫下，固定激發和發射波長，掃描體系的熒光光譜圖，結果如圖5所示。由圖可知，腎上腺色腙對GQDs有明顯的熒光猝滅作用，且GQDs的熒光強度隨著腎上腺色腙濃度的增加有規律地下降，說明腎上腺色腙和量子點發生了相互作用。

3.2.2緩沖溶液PH、種類及用量的選擇

不同PH對體系ΔF值的影響不同。實驗考察了不同PH對體系熒光強度的影響，結果表明，PH＝7.40時，體系的ΔF值最大。同時考察了同一PH值下Na2HPO4-NaH2PO4、Tris-HCl、B-R、檸檬酸-Na2HPO4和NaOH-KH2PO4等緩沖溶液對體系熒光強度的影響。當緩沖溶液為Tris-HCl時，腎上腺色腙對GQDs體系的猝滅作用最強，其適宜用量為3.00 mL。所以本實驗選擇3.00 mL的Tris-HCl緩沖溶液來調節體系酸度。

圖5　GQDs-CBZC體系的熒光光譜Fig.5　Fluorescence spectra of GQDs-CBZC sYstem

3.2.3GQDs濃度的選擇

量子點的濃度直接影響著體系的靈敏度和線性范圍。我們試驗了不同用量的量子點對體系熒光強度的影響。結果表明，當量子點用量為3.00 mL時，體系的猝滅程度最大。實驗選擇加入3.00 mL的量子點，其濃度為2.3×10-3mol/L。

3.2.4增敏劑對體系的影響

試驗了一系列的金屬離子和納米粒子對腎上腺色腙猝滅量子點的熒光強度的協同作用。如Cu2＋、Ba2＋、Ca2＋、Mg2＋、Mn2＋、Zn2＋、AgNP和AuNP，結果均無明顯影響。表面活性劑對體系有強的增敏、增溶、增穩作用，因此實驗研究了十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）、吐溫80（Tween-80）、溴化十六烷基三甲基銨（CTMAB）、β-環糊精（β-CD）等對體系猝滅程度的影響。結果表明，上述幾種表面活性劑和β-環糊精對體系ΔF值均無增敏作用。所以，本實驗選擇不加入任何增敏劑。

3.2.5反應時間及試劑加入順序的影響

配制好溶液，每隔10 min測定一次熒光強度。結果表明，腎上腺色腙對GQDs的猝滅程度在反應20 min后最大，且熒光強度在4 h內基本穩定。試劑加入順序對體系熒光強度幾乎沒有影響。

3.2.6共存物質干擾

在選定的實驗條件下，當腎上腺色腙濃度為4.0×10-6mol/L時，以相對誤差不超過±5%為限，1 000倍的葡萄糖、果糖、蔗糖，500倍的Ca2＋、K＋、Sr2＋、Ba2＋，100倍的Cu2＋、Al3＋、Zn2＋，5倍的Fe3＋不干擾測定。

3.2.7檢出限和線性范圍

在優化的實驗條件下，腎上腺色腙溶液在4.0×10-7～1.2×10-5mol/L濃度范圍內與ΔF呈良好的線性關系，線性回歸方程為ΔF＝2.5× 107c（mol/L）＋10.3，相關系數為0.995 6。對濃度為4.0×10-6mol/L的腎上腺色腙溶液平行測定5次，其相對標準偏差為0.15%。根據IUPAC建議計算，方法檢出限為1.5×10-7mol/L。

3.2.8樣品分析

隨機抽取同一批號的腎上腺色腙片劑20片，準確稱取其質量，研磨，稱取適量粉末（相當于0.023 6 g腎上腺色腙），用蒸餾水溶解并超聲5 min后定容于100 mL容量瓶中，搖勻，靜置10 min，干過濾，棄去初濾液，移取一定量后續過濾溶液，按照實驗方法測定，同時進行加標回收實驗，結果見表1。

表1　樣品測定及回收率實驗（n＝5）Tab.1 Determination results of carbazochrome in samPles and recoverY of the method（n＝5）

3.3機理討論

在熒光發射過程中，熒光試劑在不同的溶劑中通過和其他物質的分子、離子碰撞導致熒光強度會迅速減弱以致完全失去熒光，稱為熒光猝滅。導致熒光猝滅的因素很多，主要包括激發態反應、能量轉移、生成配合物和碰撞猝滅等[17]。碰撞猝滅又稱為動態猝滅。靜態猝滅是由于生成配合物而引起的熒光猝滅。本實驗通過溫度對猝滅常數的影響和紫外-可見吸收光譜的變化來探討腎上腺色腙和量子點之間的作用機理。

3.3.1紫外-可見吸收光譜

靜態猝滅是猝滅劑與基態熒光分子形成無熒光或弱熒光的配合物，從而改變熒光物質的吸收光譜。固定量子點和腎上腺色腙溶液的濃度，以緩沖溶液為參比，分別做GQDs、CBZC、GQDs＋CBZC的紫外-可見吸收光譜，如圖6所示。從圖中得知，腎上腺色腙在353 nm處有最大吸收，GQDs加入后，最大吸收波長未發生變化，吸光度明顯增大。但通過比較發現，GQDs＋CBZC體系的吸光度是GQDs和CBZC二者的吸光強度之和，說明腎上腺色腙和量子點沒有生成配合物，由此證明腎上腺色腙對量子點的熒光猝滅機理可能為動態猝滅。

圖6　GQDs、CBZC、GQDs＋CBZC的紫外-可見吸收光譜。Fig.6　Ultraviolet-visible absorPtion spectra of GQDs，CBZC and GQDs＋CBZC，resPectivelY.CCBZC＝4.0×10-6mol/L.

3.3.2溫度對猝滅常數的影響

動態猝滅是猝滅劑與熒光試劑的激發態分子之間發生相互作用的過程。隨著溫度的升高，分子之間的有效碰撞增加，電子轉移過程加劇，這種變化遵守Stern-Volmer方程[18]:F0/F＝1＋Kqτ0[Q]＝ 1＋KSV[Q]。其中，F0和F分別為無猝滅劑和有猝滅劑時的熒光強度，τ0是不存在猝滅劑時的熒光分子的平均熒光壽命，KSV為Stern-Volmer猝滅常數，[Q]為猝滅劑的濃度，Kq為雙分子猝滅過程速率常數。

依據Stern-Volmer方程，對F0/F和[Q]進行線性回歸，所得直線的斜率為KSV。如圖7所示，在293 K和313 K條件下，腎上腺色腙的[Q]和F0/F線性關系良好，說明只存在一種猝滅方式，靜態猝滅或動態猝滅。通過比較，隨著溫度的升高KSV逐漸增大，說明腎上腺色腙與GQDs是以動態猝滅的方式發生相互作用的。

圖7　腎上腺色腙對GQDs熒光猝滅的Stern-Volmer曲線Fig.7　Stern-Volmer Plot of GQDs quenched by CBZC

3.3.3結合常數、結合位點數、熱力學參數及作用力類型

以lg[（F0-F）/F]對lg[Q]作圖，直線的斜率為結合位點數n，截距為lgKA。由表2數據可知，量子點和腎上腺色腙的結合位點數n≈1，結合常數KA均比較大，說明二者具有較強的結合作用。KA也隨著溫度的升高而增大，表明腎上腺色腙對量子點的猝滅為動態猝滅。

表2　腎上腺色腙和GQDs的結合常數、結合位點數和熱力學參數Tab.2 Binding constants，number of binding sites and thermodYnamics Parameters of GQDs-CBZC

利用Vant'Hoff方程可以計算出熱力學參數焓變ΔH、熵變ΔS、吉布斯自由能ΔG:根據公式計算得出各熱力學參數，如表2所示。ΔG＜0，表明該反應可自發進行;而在腎上腺色腙和量子點結合的過程中，ΔH＞0，ΔS＞0，表明腎上腺色腙和量子點之間的作用力為疏水作用力，原因可能為腎上腺色腙表面的羥基和量子點表面的羧基發生脫水而產生的疏水作用力。

4　結 論

通過高溫裂解檸檬酸的方法并經過PEG2000修飾鈍化合成了石墨烯量子點。通過紅外光譜、熒光壽命和紫外-可見吸收光譜等方法對其進行了表征。在PH＝7.40的Tris-HCl緩沖液介質中，腎上腺色腙對量子點熒光有很強的猝滅作用，據此建立了以石墨烯量子點為熒光探針定量測定腎上腺色腙的新方法。該方法快速、簡單，可用于樣品中腎上腺色腙的含量測定。通過測定溫度對猝滅常數的影響和吸收光譜的變化探討了二者的猝滅機理。結果表明:腎上腺色腙與石墨烯量子點之間是以動態猝滅的方式發生相互作用，二者之間為疏水作用力。該方法為研究量子點和藥物間的相互作用提供了一定的實驗依據，同時為測定腎上腺色腙提供了新方法。

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馬紅燕（1966-），女，陜西延安人，教授，碩士生導師，2014年于陜西師范大學獲得碩士學位，主要從事光譜分析方面的研究。

E-mail:MahY6614@163.com

王艷妮（1990-），女，陜西咸陽人，碩士研究生，2013年于延安大學獲得學士學位，主要從事分子光譜分析方面的研究。

E-mail:396262792@qq.com

Detection of Carbazochrome by Graphene Quantum Dot Fluorescence Probe

MA Hong-Yan*，WANG Yan-ni

（College of Chemistry ɑnd Chemicɑl Engineering，Shɑɑnxi Key Lɑborɑtory of Chemicɑl Reɑction Engineering，Yɑn'ɑn Uniυersity，Yɑn'ɑn 716000，Chinɑ）

，E-mɑil:Mɑhy6614@163.com

Water-soluble graPhene quantum dots（GQDs）were sYnthesized by the PYrolYsis of citric acid.Its fluorescent quantum Yield was remarklY increased by PEG2000 modified.The luminescence characteristics of GQDs were studied by fluorescence sPectroscoPY，ultraviolet-visible sPectroscoPY，infrared sPectroscoPY as well as the fluorescence lifetime.A novel method for quantitative determination of trace carbazochrome（CBZC）was develoPed based on the fluorescence quenching of GQDs in PH 7.40 Tris-HCl buffer solution.A wide range of reaction Parameters，such as concentration of GQDs，reaction time，surfactant，sorts and amount of buffer was examined.The screening results show that the ΔF was linearlY related with the carbazochrome concentration from 4.0×10-7to 1.2×10-5mol/L（0.995 6）with the detection limit of 1.5×10-7mol/L.The relative standard deviation is 0.15%（n＝5，c＝4.0×10-6mol/L），when the concentration of GQDs is 2.3×10-3mol/L.The method has been used for the determination of carbazochrome in samPles with the recoveries of 97.46%-101.6%.The interaction mechanism and main sorts of binding force between GQDs and carbazochrome were investigated by the temperature effect on the quenching constants and UV-visible absorPtion sPectrometrY.

graPhene quantum dots（GQDs）;fluorescence Probe;carbazochrome（CBZC）;citric acid

O657.3

A DOI:10.3788/fgxb20163702.0230

1000-7032（2016）02-0230-07

2015-09-18;

2015-12-08

陜西省自然科學基礎研究計劃（2014JM2056）;延安大學研究生科研創新項目資助