黃芪注射液對胃癌大鼠血清炎癥機制、p53、STAT3、VEGF表達的影響

王道軍　王　晨　伍　權　丁守勇　方恒忠　徐　弘　張　超　王　斌

(蕪湖市第二人民醫院，安徽　蕪湖　241000)

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·基礎研究·

黃芪注射液對胃癌大鼠血清炎癥機制、p53、STAT3、VEGF表達的影響

王道軍王晨伍權1丁守勇2方恒忠2徐弘2張超3王斌3

(蕪湖市第二人民醫院，安徽蕪湖241000)

目的探討黃芪注射液對胃癌大鼠血清炎癥機制、p53、信號轉導與激活因子(STAT)3、血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達的影響。方法Wistar大鼠50只隨機分為空白組、模型組、黃芪注射液低劑量組(低劑量組)、中劑量組、高劑量組，每組10只。空白組給予大鼠等劑量生理鹽水灌胃；模型組于制模成功后給予等劑量生理鹽水灌胃；低、中、高劑量組于制模成功后分別給予黃芪注射液0.2、0.4、0.6 ml/100 g體重腹腔注射，1次/d。酶聯免疫吸附法測定血清炎癥因子水平和免疫組化法測定p53、STAT3、VEGF表達。結果與空白組比較，模型組及各劑量組血清白細胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量明顯上升(P<0.05)；各劑量組血清IL-6、IL-10、TNF-α含量明顯低于模型組，且隨劑量增加各因子含量降低越明顯(P<0.05)；與空白組比較，模型組及各劑量組p53、STAT3、VEGF陽性表達評分明顯增加(P<0.05)；各劑量組p53、STAT3、VEGF陽性表達評分明顯低于模型組，且隨劑量增加評分越低(P<0.05)。結論黃芪注射液可明顯減輕胃癌大鼠炎癥反應，降低p53、STAT3、VEGF表達。

黃芪注射液；胃癌；炎癥機制；p53；STAT3；VEGF

胃癌病因尚不十分明確，對其治療以手術為主。手術后化療成為重要治療手段，但其效果并不十分理想，化療藥物對機體正常細胞具有一定損傷，致使免疫力下降〔1，2〕。黃芪注射液是常用的一種扶正中藥，現代藥理研究表明黃芪注射液具有良好的抗腫瘤作用〔3〕。本研究旨在分析黃芪注射液對胃癌大鼠血清炎癥機制、p53、信號傳導與激活因子3(STAT3)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物和藥物實驗動物：Wistar大鼠50只，SPF級，雌雄各半，體質量(200±20)g，由北京維通利華公司提供，合格證號：SCXK(京)2007-0001。常規飼養1 w，自由飲食、飲水，維持室溫為23℃～25℃，相對濕度70%。實驗藥物：黃芪注射液(生產廠家：上海福達制藥有限公司；批準文號：國藥準字Z31020083；規格：每支裝5 ml，相當于原藥材10 g)。

1.2主要儀器及試劑盒日本OLYMPUS公司生產CX41生物顯微鏡，美國Bio-Rad公司伯樂對3000型電泳儀。p53抗體購于Santa Cruz公司、STAT3抗體購于Santa Cruz公司、VEGF多克隆抗體購于Santa Cruz公司，白細胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3實驗分組50只大鼠隨機分為空白組、模型組、黃芪注射液低劑量組(低劑量組)、黃芪注射液中劑量組(中劑量組)、黃芪注射液高劑量組(高劑量組)，每組大鼠10只。

1.4胃癌模型制備每組大鼠根據200 mg/kg于腹部給予阿糖胞苷，皮下注射48 h后根據10 Gy吸收劑量進行60Co全身照射，照射后第2天于大鼠內側近腹股溝處皮下接種胃癌細胞懸液0.8 ml，接種細胞數5×106/只，制成胃癌大鼠模型。造模過程中模型組2只大鼠和低劑量組1只大鼠不明原因死亡。

1.5給藥方法空白組給予大鼠等劑量生理鹽水灌胃；模型組于模型制備成功后給予等劑量生理鹽水灌胃；低劑量組于模型制備成功后給予黃芪注射液0.2 ml/100 g體重，腹腔注射，每日1次；中劑量組于模型制備成功后給予黃芪注射液0.4 ml/100 g體重，腹腔注射，1次/d；高劑量組于模型制備成功后給予黃芪注射液0.6 ml/100 g體重，腹腔注射，1次/d。

1.6酶聯免疫吸附法測定血清炎癥因子水平于大鼠腹主動脈取血，裝于不含抗凝劑的試管內，室溫下自然凝集20～30 min，離心，分離血清，置于-80℃保存待測，采用酶聯免疫吸附法測定血清炎癥因子含量。

1.7免疫組化法測定p53、STAT3、VEGF表達取儲存于-80℃下胃癌組織100 mg，組織切片，所有標本切片，厚度5 μm，收至備用的玻片上，將其置于58℃烤箱中烘干熔蠟60 min；脫蠟、水化組織切片，采用3%過氧化氫去離子水孵育6 min，阻斷內源性過氧化物酶，再將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液容器中，于95℃持續15 min，取出容器，切片4℃下冷卻20 min，再以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min；滴加1∶100兔抗P53、STAT3、VEGF多克隆抗體，4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min；滴加山羊抗兔IgG抗體辣根過氧化物酶(HRP)多聚體，室溫條件下放置30 min，PBS沖洗3次，每次2 min；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，將切片加上DAB顯色劑，于顯微鏡下觀察染色程度，染色好的切片采用自來水終止顯色，用自來水沖洗10 min；在將切片放入蘇木精迅速泡一下用自來水沖洗10 min，將切片放入乙酸迅速泡一下用自來水沖洗10 min；切片以75%、85%、95%乙醇分別浸泡脫水1 min，將切片用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ浸泡5 min透明，將切片自然晾干，滴上中性樹膠封片，將封好了切片放入烤箱中過夜，在光學顯微鏡下觀察結果。陽性結果：陽性細胞判定以腫瘤細胞胞核內出現棕色顆粒為準，于高倍鏡下隨機取10個不同視野，各計數100個細胞，結果采用半定量分析。首先對陽性細胞染色強度評分，以無色為0分，以淡黃色為1分，以棕褐色為2分，以棕褐色為3分；再對陽性細胞所占百分比評分，0分為陰性，以陽性細胞≤10%為1分，以陽性細胞占11%～50%為2分，以陽性細胞占51%～75%為3分，以陽性細胞占>75%為4分，結果取二者評分乘積，染色強度與陽性細胞百分比乘積>3分為陽性。

1.8瘤組織處理采用甲醛液對胃癌組織進行充分固定，常規脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，采用光鏡下觀察胃癌組織學變化。

1.9統計學方法應用SPSS19.0軟件，采用獨立樣本t檢驗或雙因素方差分析。

2　結　果

2.1各組胃癌組織光學顯微鏡下觀察空白組：大鼠胃黏膜上皮完整，以及細胞形態大小均一，胃竇部和胃體無明顯炎細胞浸潤；模型組：大鼠胃黏膜大部分萎縮消失，可見腸化生杯狀細胞，部分腺體結構不規則；低劑量組：大鼠胃竇部和胃體炎癥較模型組輕，且鏡下可見上皮壞死細胞脫落，且可出現糜爛；中劑量組和高劑量組胃黏膜上皮相對較完整，細胞形態均一，以及固有膜內腺體排列較整齊。見圖1。

2.2各組大鼠血清炎癥因子含量比較與空白組比較，模型組及各劑量組血清IL-6、IL-10、TNF-α含量明顯上升(P<0.05)；各劑量組血清IL-6、IL-10、TNF-α含量明顯低于模型組，且隨著劑量增加，含量降低越明顯(P<0.05)。

2.3各組大鼠p53、STAT3、VEGF陽性表達評分比較與空白組比較，模型組及各劑量組p53、STAT3、VEGF陽性表達評分明顯增加(P<0.05)；各劑量組p53、STAT3、VEGF陽性表達評分明顯低于模型組，且隨劑量增加評分降低(P<0.05)。見表1。

圖1　各組胃癌組織光學顯微鏡下觀察(HE，×200)

組別nIL-6(pg/ml)IL-10(pg/ml)TNF-α(ng/ml)p53蛋白STAT3蛋白VEGF蛋白空白組10204.38±27.4186.23±13.4218.92±2.140.72±0.180.68±0.200.83±0.23模型組8319.82±29.311)249.81±48.311)27.31±2.351)2.85±0.431)2.76±0.671)2.80±0.571)低劑量組9278.48±21.291)2)179.32±34.511)2)25.10±2.091)2)2.21±0.371)2)3)2.08±0.341)2)2.16±0.381)2))中劑量組10251.38±20.911)2)3)143.28±27.161)2)3)23.41±1.871)2)3)1.64±0.291)2)3)4)1.59±0.351)2)3)4)1.69±0.311)2)3)4)高劑量組10225.41±18.491)2)3)4)118.92±24.291)2)3)4)21.08±1.561)2)3)4)1.03±0.231)2)3)4)0.91±0.211)2)3)4)1.14±0.241)2)3)4)

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與低劑量組比較：3)P<0.05；與中劑量組比較：4)P<0.05

3　討　論

中醫學認為胃癌屬“反胃”、“胃脘痛”、“積聚”等范疇，主要是由氣血虛弱易發生血瘀、痰凝、氣滯，損傷脾腎、耗氣傷陰致病〔4,5〕。黃芪注射液可增強患者機體免疫功能，監控與殺傷癌細胞，同時還可提高巨噬細胞活性，調節機體內環境平衡，從而改善宿主的免疫抑制狀態〔6，7〕。本研究結果表明，黃芪注射液可通過降低大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α含量，增強其免疫功能。VEGF可誘導血管內皮細胞的有絲分裂，直接刺激血管生成，同時也可誘導血管通透性增加，從而對于血管生長具有重要作用〔8〕。本研究結果表明，黃芪注射液可通過抑制VEGF表達，抑制新生血管形成，從而阻斷或逆轉胃癌，可能為其治療胃癌重要機制。p53過表達和基因突變在腫瘤的啟動和進展期均起作用，并且發生于癌前病變各個階段〔9〕。本研究結果表明，黃芪注射液可通過抑制P53表達，發揮抗腫瘤作用。STAT3是一種信號傳導與轉錄激活因子，該因子于多種細胞生長、凋亡、分化中發揮重要作用〔10〕。STAT3蛋白在胃癌組織中高表達，能夠作為胃癌診斷和預后的一種分子標志物，且能夠為胃癌診斷、治療提供新的思路〔11〕。本研究說明黃芪注射液可通過抑制STAT3表達，發揮抗腫瘤作用。

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2劉慶生,蔡丹莉,陳芝蕓,等.益氣活血方對胃癌前病變大鼠NF-κB、cyclinD1和p16表達的影響〔J〕.中華中醫藥學刊,2014;34(8):1979-82.

3顏莉芳.黃芪注射液穴位注射治療中晚期惡性腫瘤的臨床觀察〔J〕.現代中醫藥,2014;14(1):48-9.

4劉貝,楊金坤,趙立宇.中醫健脾干預治療對胃癌術后患者生存質量影響分析〔J〕.遼寧中醫藥大學學報,2015;17(12):73-5.

5田永立,夏寧俊,李烜,等.中西醫結合臨床路徑方案治療胃癌患者100例臨床觀察〔J〕.中醫雜志,2014;55(22):1921-5.

6尹軍平,呂桂泉.胃癌術后早期化療結合中醫輔助治療的臨床觀察〔J〕.中華中醫藥學刊,2013;28(12):2830-2.

7李廣濤.艾迪注射液和黃芪注射液治療晚期胃癌的對比臨床觀察〔J〕.中國醫學工程,2013;21(3):80-1.

8歐玉榮,康敏,周蕾,等.胃癌中幽門螺桿菌L型感染與MIF、MMP9、VEGF表達的關系〔J〕.南方醫科大學學報,2014;34(2):180-7.

9王名法,劉友斌.XPF、p53蛋白在胃癌組織中的表達及與幽門螺桿菌L型感染的關系〔J〕.臨床與實驗病理學雜志,2015;31(10):1089-94.

10蔡根深,王延麗,李美麗,等.復方蜥蜴散不同微粒組合劑對胃癌前病變大鼠Stat3通路Stat3、Bcl-2蛋白表達影響的實驗研究〔J〕.時珍國醫國藥,2014;25(5):1028-32.

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〔2015-04-16修回〕

(編輯袁左鳴)

The effect analysis of astragalus injection on the inflammatory mechanisms of gastric cancer in rats serum,and the expression of p53,signal transducer and activator of transcription3 and vascular endothelial growth factor

WANG Dao-Jun,WANG Chen,WU Quan,et al.

The Second People's Hospital of Wuhu,Wuhu 241000,Anhui,China

ObjectiveTo investigate the effect of astragalus injection on the inflammatory mechanisms of gastric cancer in rats serum,and the expressions of p53,signal transducer and activator of transcription3 (STAT3) and vascular endothelial growth factor(VEGF).Methods50 Wistar rats were randomly divided into blank (n=10),model (n=10),astragalus injection of low-dose (LG)(n=10),medial-dose (MG)(n=10) and high-dose (HG) groups (n=10).The inflammatory factors levels were tested by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) and the expressions of p53,STAT3 and VEGF were measured by immunohistochemistry(IHC).ResultsCompared with those of blank group,the serum IL-6,IL-10,TNF-α contents in model group were significantly increased in each dose (P<0.05);the serum IL-6,IL-10,TNF-α contents in each dose were significantly lower than those of model group,and the contents were decreased obviously with the increasing dosage (P<0.05).Compared with those of blank group,the positive expression of p53,STAT3 and VEGF in model group and each dose groups were significantly increased (P<0.05);the positive expressions of p53,STAT3 and VEGF in each dose were significantly lower than those of model group (P<0.05).ConclusionsThe astragalus injection might significantly reduce the inflammatory reaction of gastric cancer in rats and the expressions of p53,STAT3 and VEGF.

Astragalus injection;Gastric cancer;Inflammatory mechanism;p53;STAT3;VEGF

國家自然科學基金(No.81001046);安徽省教委基金資助項目(No.95LJ0072)

王晨(1965-)，男，碩士，主任醫師，主要從事急診與創傷研究。

王道軍(1978-)，男，碩士，主治醫師，主要從事急診醫學研究。

R392.7

A

1005-9202(2016)18-4405-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.001

1安徽醫科大學附屬省立醫院呼吸科

2安徽醫科大學附屬省立醫院外科

3安徽醫科大學第四附屬醫院腫瘤科