尋常性銀屑病患者皮損及外周血miRNA表達譜的研究

王曉華 饒朗 禹歡歡 陳文靜 鄭道城 陳永鋒

510091廣州，廣東省皮膚病醫(yī)院皮膚科（王曉華、陳文靜、鄭道城、陳永鋒）；成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科（饒朗）；河南省中醫(yī)院皮膚科（禹歡歡）

尋常性銀屑病患者皮損及外周血miRNA表達譜的研究

王曉華 饒朗 禹歡歡 陳文靜 鄭道城 陳永鋒

510091廣州，廣東省皮膚病醫(yī)院皮膚科（王曉華、陳文靜、鄭道城、陳永鋒）；成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科（饒朗）；河南省中醫(yī)院皮膚科（禹歡歡）

目的探討尋常性銀屑病患者皮損及外周血miRNA表達譜系，尋找表達一致的miRNA。方法用基因芯片技術(shù)篩選17例銀屑病皮損和外周血miRNA，通過驗證篩選出差異性miRNA，探討其與銀屑病皮損和面積嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）的相關(guān)性。結(jié)果利用AgilentHumanmiRNA芯片技術(shù),得出銀屑病皮損和外周血中相一致的15個miRNA，經(jīng)過RT?qPCR技術(shù)驗證，表達一致的miRNA有7個，其中miR?30e?5p、miR?192?5p、miR?17?3p、miR?1227?5p的表達量與銀屑病患者PASI評分呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；miR?125b?5p、miR?642a?5p、miR?29a?5p與PASI評分無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論尋常性銀屑病患者皮損組織和血漿中存在著表達一致的miRNA，這些miRNA有望作為評估銀屑病患者病情嚴(yán)重程度的生物標(biāo)記物之一。

銀屑病；微RNAs；芯片分析技術(shù)；基因表達譜；疾病嚴(yán)重程度指數(shù)

miRNA是一類非編碼的單鏈小分子RNA，它們通過抑制翻譯或誘導(dǎo)靶基因mRNA降解參與人類約1/3基因的表達調(diào)控，參與細(xì)胞的增殖、分化、代謝、凋亡等多種生物學(xué)過程［1］。miRNA在銀屑病、特應(yīng)性皮炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白癜風(fēng)、系統(tǒng)性硬皮病、男性脫發(fā)、皮膚基底細(xì)胞癌、黑素瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著調(diào)控作用［2］。關(guān)于miRNA與銀屑病的相關(guān)研究已有報道，但對同一銀屑病患者皮損與血漿中miRNA表達水平情況尚不明確。我們采用miRNA基因芯片技術(shù)和實時熒光定量PCR法對尋常性銀屑病患者外周血及皮損組織中miRNA進行分析。

對象與方法

一、臨床資料

2014年2-12月，廣東省皮膚病醫(yī)院皮膚科臨床和組織病理診斷為尋常性銀屑病的患者17例，男10例，女7例，年齡23～60歲，病程5個月至15年，17例患者均為斑塊狀銀屑病，銀屑病皮損和面積嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）評分為20.2～40.2分，皮損部位包括胸背部10例、四肢6例、頭面部1例。健康對照組成人4例，男2例，女2例，年齡22～30歲，來源于廣東省皮膚病醫(yī)院整形外科整形患者的全血及皮膚組織，腕部皮膚組織采取轉(zhuǎn)孔法取材。所有患者近3個月內(nèi)未系統(tǒng)服用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物；1個月內(nèi)未接受紫外線等治療，未外用糖皮質(zhì)激素或其他制劑等藥膏；無合并先天或獲得性自身免疫性疾病及其他免疫相關(guān)性或炎癥性、真菌感染疾病；無凝血障礙性疾病等。本研究經(jīng)廣東省皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

二、材料

總RNA抽提試劑Trizol（美國Invitrogen公司），miRNA分離試劑盒（AmbionmiRNA Isolation Kit，美國Ambion公司）。熒光標(biāo)記、芯片（Agilent Human miRNA芯片）雜交、miRNA引物、結(jié)果檢測等在上海博豪生物科技有限公司實驗室進行，相關(guān)試劑與器材由該公司提供。AgilentHumanmiRNA芯片V19.0數(shù)據(jù)庫來源于SangermicroRNA數(shù)據(jù)庫（miRBase）19.0版本，覆蓋2006個人類相關(guān)的miRNA。

三、方法

1.RNA提取及檢測：血液標(biāo)本3～5ml注入無菌采血管中，室溫放置2～3 h，離心3min，5～10min內(nèi)使用，取上層血清。用苯酚/氯仿去蛋白處理，乙醇沉淀RNA成分，加入焦炭酸二乙酯水溶解，紫外分光光度測定提取RNA純度。A260/A280的比值＞1.8，每樣品取1μg RNA用于后續(xù)實驗。

組織樣本：將組織樣品0.1g放入預(yù)冷的研缽中加入液氮進行研磨，等組織樣品成粉末狀，在液氮基本揮發(fā)完時，在每個研缽中加2～3ml Trizol試劑，冷凍離心5min。取上清液在微量離心管中，加入氯仿，劇烈振蕩混勻30 s，使水相和有機相充分接觸，室溫靜置15min，冷凍離心5min；去上清，加入50μl焦炭酸二乙酯水溶解，紫外分光光度測定提取RNA純度。總RNA在1%甲醛變性的瓊脂糖凝膠中電泳（80 V 30 min），染色后觀察5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA條帶。每樣品取1μg RNA用于后續(xù)實驗。

2.基因芯片技術(shù)檢測銀屑病患者皮損及血漿miRNA：將4例健康對照組的皮膚、血漿RNA進行混合，患者樣品不混合單一樣本上機，均采用miRCURYARRAY標(biāo)記試劑盒，用標(biāo)記酶將CY3熒光基團標(biāo)記miRNA。芯片雜交：①配制雜交液180μl：miRNA標(biāo)記產(chǎn)物12.5μl、1.5混合緩沖液90μl、無核酸酶水77.5μl等混勻；②95℃孵育2min；③孵育后冰上放置2min；④使用熱收縮雜交袋雜交過夜。

miRNA芯片清洗及掃描分析：①雜交后，芯片用緩沖液A于56℃洗2min；②用緩沖液B于室溫洗芯片2min；③用緩沖液C于室溫洗芯片2min；④用清水洗芯片，離心5min，芯片干燥后立即掃描；⑤分析得出特異性表達的miRNA。單熒光芯片的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，轉(zhuǎn)化為log以2為底的對數(shù)后，在一個二維直角坐標(biāo)系平面中繪制散點圖。s＞1為表達上調(diào)，s＜1為表達下調(diào)。

3.RT?qPCR技術(shù)驗證差異miRNA的表達：反轉(zhuǎn)錄將總RNA做適當(dāng)?shù)臐舛日{(diào)整，進行反應(yīng)體系的配置，包括miRNA特異反轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄酶及反應(yīng)緩沖液，配置過程按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。定量PCR檢測：將上述實驗得到的cDNA取適量放入管中，參照熒光定量PCR檢測試劑盒說明書加入上下游引物。將準(zhǔn)備好的反應(yīng)物放入實時熒光定量PCR系統(tǒng)中。設(shè)置反應(yīng)參數(shù)：95℃1min；95℃30 s，68℃30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

4.統(tǒng)計分析：用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)采用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PASI評分相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson相關(guān)檢驗，P＜0.05有相關(guān)性，r＞0為正相關(guān)，r＜0為負(fù)相關(guān)。

結(jié)果

一、基因芯片檢測銀屑病患者皮損和血漿表達差異miRNA

銀屑病患者皮損中有90個差異表達miRNA，其中60個表達上調(diào)［待比較的兩個標(biāo)準(zhǔn)化后的信號相除所得的值（FC）＞1.5］，30個表達下調(diào)（FC＜1.5，圖1A）；血漿中有49個差異表達miRNA，其中38個表達上調(diào)，11個表達下調(diào)（圖1B）；miR?6510?5p、miR?6510?3p、miR?4298、miR?1275、miR?320c在皮損和血漿中同時表達上調(diào)；miR?1227?5p、miR?17?3p、miR?483?5p、miR?30e?5p、miR?192?5p、miR?let?7a?5p在皮損和血漿中同時表達下調(diào)；而miRNA?3940?5p、miR?125b?5p、miR?642a?5p、miR?29a?5p在皮損中表達上調(diào)但血漿中表達下調(diào)（P＜0.01、FC＞1.5）（圖1C）。

圖1尋常性銀屑病患者皮損與血漿中芯片數(shù)據(jù)散點圖X軸：該點在對照芯片中標(biāo)準(zhǔn)化以后的信號值；Y軸：該點在樣品芯片中標(biāo)準(zhǔn)化以后的信號值。散落在圖形中y=x直線（圖上的中位線）上的點，代表這個探針點在兩張芯片中信號值差異Fold Change=1；落在圖形中位線兩側(cè)45°線之外的點，代表這個探針點在兩張芯片中信號值差異Fold Change＞2，其中A區(qū)代表上調(diào)2倍的基因，B區(qū)代表下調(diào)2倍的基因1A：皮損組織；1B：血漿；1C：皮損組織與血漿差異性表達一致的miRNA散點圖

二、qRT?PCR技術(shù)驗證皮損和血漿差異表達的15個miRNA

銀屑病患者皮損中miR?1227?5p、miR?6510?5p、miR?6510?3p、miR?4298、miR?1275、miR?17?3p、miR?483?5p、miR?30e?5p、miR?192?5p、miRNA?3940?5p表達下調(diào)（P＜0.05），miR?320c、miR?let?7a?5p、miR?125b?5p、miR?642a?5p、miR?29a?5p表達上調(diào)（P＜0.05）；在患者外周血中miR?1227?5p、miR?6510?5p、miR?6510?3p、miR?4298、miR?1275、miR?17?3p、miR?30e?5p、miR?192?5p、miR?320c、miR?let?7a?5p、miR?125b?5p、miR?642a?5p、miR?29a?5p表達下調(diào)（P＜0.05），miR?483?5p表達上調(diào)（P＜0.05），miRNA?3940?5p表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。基因芯片和qRT?PCR驗證表達一致的有：miR?1227?5p、miR?30e?5p、miR?192?5p、miR?17?3p在皮損和外周血漿中表達下調(diào)；miR?125b?5p、miR?642a?5p、miR?29a?5p在皮損組織中上調(diào)，而在外周血漿中下調(diào)。

三、PASI評分相關(guān)性檢測

qRT?PCR驗證結(jié)果與芯片一致的7個miRNA中，miR?30e?5p、miR?192?5p、miR?17?3p、miR?1227?5p在皮損和外周血中表達均下調(diào)，表達量與PASI評分呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；miR?125b?5p、miR?642a?5p、miR?29a?5p與PASI評分無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。4個miRNA基本信息見表1。

表1 與銀屑病皮損和面積嚴(yán)重度指數(shù)評分呈負(fù)相關(guān)4個miRNA

討論

銀屑病的發(fā)病機制復(fù)雜，研究認(rèn)為其發(fā)病是依賴于各種細(xì)胞群如：成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、單核細(xì)胞來源的免疫細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞等激活機制異常的總和，而每種細(xì)胞的表達又有相應(yīng)的miRNA進行調(diào)節(jié)。近年來一些學(xué)者對斑塊狀銀屑病、特應(yīng)性皮炎進行疾病特異性miRNA的檢測和分析，發(fā)現(xiàn)如角質(zhì)形成細(xì)胞來源的miR?203特異性高表達于銀屑病皮損中，miR?21則同時高表達于銀屑病和特應(yīng)性皮炎皮損中，miR?99b特異性低表達于銀屑病皮損中，還有miR?112a則在兩種疾病中均表達減少，提示miRNA與銀屑病和特應(yīng)性皮炎有著密切的聯(lián)系。目前有3個銀屑病相關(guān)的miRNA受到關(guān)注，即miR?203、miR?146a和miR?125b［3?4］。

本研究通過基因芯片技術(shù)篩選了銀屑病患者皮損組織及血漿中miRNA，發(fā)現(xiàn)共表達的miRNA有15個，miR?1227?5p、miR?30e?5p、miR?192?5p、miR?17?3p在皮損和外周血中表達下調(diào)；miR?125b?5p、miR?642a?5p、miR?29a?5p在皮損中上調(diào)，而在外周血中下調(diào)。經(jīng)過qRT?PCR驗證與基因芯片相一致的有7個miRNA，分別為miR?30e?5p、miR?192?5p、miR?17?3p、miR?1227?5p、miR?125b?5p、miR?642a?5p、miR?29a?5p。目前研究最多的miR?125b?5p在患者皮損內(nèi)和血漿中均下調(diào)，而在本文中miR?125b在銀屑病患者皮損中表達是上調(diào)，與國外研究有所不同［5］，在血漿中是下調(diào)與國外研究相一致［6］。

本研究分析了差異表達的miRNA與銀屑病疾病嚴(yán)重程度（PASI評分）的相關(guān)性，miR?125b?5p、miR?642a?5p、miR?29a?5p未發(fā)現(xiàn)與PASI評分有明顯的直線相關(guān)，miR?30e?5p、miR?192?5p、miR?17?3p、miR?1227?5p在皮損組織和外周血中表達下調(diào)，與PASI評分呈負(fù)相關(guān)，即病情越嚴(yán)重，miRNA表達量越低。由此，我們推測其可作為評估銀屑病患者病情嚴(yán)重程度的生物標(biāo)記物。目前有關(guān)這4種miRNA在銀屑病中尚未見有關(guān)報道。有研究發(fā)現(xiàn)，miR?1227?5p在2型糖尿病腎病患者的表達量明顯下降［7］。目前研究已證實，miR?17?92在肝癌、食管癌、前列腺癌等多種系統(tǒng)腫瘤中過度表達，通過作用于相應(yīng)靶基因影響惡性腫瘤形成的信號通路，進而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。MiR?192?5p與miR?192?3p來源于同一前體miR?192，Mysore等［8］發(fā)現(xiàn)，miR?192?3p在脂肪細(xì)胞的代謝中可影響甘油三酯的存儲。Yan?Chun等［9］發(fā)現(xiàn)，miR?192?5p通過調(diào)控靶基因SEMA3A可促進肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和擴散。上述4種miRNA均與炎癥、腫瘤相關(guān)。由于本研究存在樣本量太少的原因，因此本課題組將繼續(xù)擴大樣本，研究驗證這4種miRNA是否可作為銀屑病的潛在診斷和預(yù)后標(biāo)志物。

［1］Almeida MI,Reis RM,Calin GA.MicroRNA history:discovery,recent applications,and next frontiers［J］.Mutat Res,2011,717（1?2）:1?8.DOI:10.1016/j.mrfmmm.2011.03.009.

［2］Ichihara A,Jinnin M,Oyama R,et al.Increased serum levels of miR?1266 in patientswith psoriasis vulgaris［J］.Eur JDermatol,2012,22（1）:68?71.DOI:10.1684/ejd.2011.1600.

［3］Taganov KD,Boldin MP,Chang KJ,etal.NF?kappaB?dependent induction of microRNA miR?146,an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses［J］.Proc Natl Acad Sci U SA,2006,103（33）:12481?12486.DOI:10.1073/pnas.0605298103.

［4］FischerM,Harvima IT,Carvalho RF,etal.Mastcell CD30 ligand is upregulated in cutaneous inflammation and mediates degranu?lation?independent chemokine secretion［J］.JClin Invest,2006,116（10）:2748?2756.DOI:10.1172/JCI24274.

［5］L?vendorf MB,Mitsui H,Zibert JR,et al.Laser capture microdissection followed by next?generation sequencing identifies disease?related microRNAs in psoriatic skin that reflect systemic microRNA changes in psoriasis［J］.Exp Dermatol,2015,24（3）:187?193.DOI:10.1111/exd.12604.

［6］Koga Y,Jinnin M,Ichihara A,etal.Analysisofexpression pattern ofserummicroRNA levels in patientswith psoriasis［J］.JDermatol Sci,2014,74（2）:170?171.DOI:10.1016/j.jdermsci.2014.01.005.

［7］Delic,Eisele C,Schmid R,et al.Urinary exosomal miRNA signature in type II diabetic nephropathy patients［J/OL］.PLoS One,2016,11（3）:e0150154.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Delic+2016+e0150154.DOI:10.1371/journal.pone.0150154.

［8］Mysore R,Zhou Y,S?devirta S,et al.MicroRNA?192*impairs adipocyte triglyceride storage［J］.Biochim Biophys Acta,2016,1861（4）:342?351.DOI:10.1016/j.bbalip.2015.12.019.

［9］Yan?Chun L,Hong?MeiY,Zhi?Hong C,etal.MicroRNA?192?5p promote the proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma cell by targeting SEMA3A［J/OL］.Appl Immunohistochem MolMorphol,2015.［published online ahead of print Nov 17,2015］.DOI:10.1097/PAI.0000000000000296.

中國麻風(fēng)史料陳列館、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所史料陳列館征集文物和史料啟事

為真實記載中國麻風(fēng)防治的發(fā)展歷程，全方位展現(xiàn)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院、研究所（簡稱院所）60余載的歷史變革和文化積淀，傳承和發(fā)揚老一輩無私奉獻的精神，院所決定籌建中國麻風(fēng)史料陳列館、院所史料陳列館。即日起，面向社會各界廣泛征集具有歷史價值的文物和史料。

一、征集范圍

①反映院所各歷史時期發(fā)展沿革、重大活動、科研成就、領(lǐng)導(dǎo)關(guān)懷及院所職工參加國內(nèi)外重大活動等方面的重要文獻、題詞、圖片、新聞報道、手稿、徽標(biāo)、紀(jì)念冊、音像制品、獎狀、證書等；②國家領(lǐng)導(dǎo)人、社會知名賢達及重要外賓、杰出校友來院所參觀、考察、訪問或演講時的題詞、圖片、新聞報道、音像制品等；③各類皮膚性病、麻風(fēng)防治的圖片、圖表及文字說明，醫(yī)、教、研、防、管等領(lǐng)域工作中使用過的辦公用品、儀器設(shè)備、書籍教案、教學(xué)工具等實物；④反映中國麻風(fēng)防治歷程及成就，麻風(fēng)受累者的醫(yī)療及生活狀況等有歷史價值的文物和史料。

二、征集方式及要求

1.文物和史料的征集采用捐贈、代管、借用等方式。

2.所有文物和史料請?zhí)峁┪淖终f明，含來源、史料載體、形成時間及其所涉及的人物、事件等要素。

3.文物和史料的征集歡迎直接送達；亦可通過電子傳送、信函郵寄、預(yù)約拜訪、登門征集等途徑進行。

4.征集的文物和史料，均登記入冊；一經(jīng)采用，除在史館陳列時標(biāo)注捐贈者的姓名外，將授贈榮譽證書。

5.征集時間：長期征集。

三、聯(lián)系方式

聯(lián)系人：210042，南京玄武區(qū)蔣王廟街12號，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所中心辦公室（科研樓415室）諸萍，電話：025-85478032，傳真：025?85424903，Email：zhup@ncstdlc.org。

M icroRNA expression profiles in peripheral blood and skin lesions of patientsw ith psoriasis vulgaris

Wang Xiaohua,Rao Lang,Yu Huanhuan,ChenWenjing,Zheng Daocheng,Chen Yongfeng

DepartmentofDermatology,Guangdong Provincial Dermatology Hospital,Guangzhou 510091,China（Wang XH,Chen WJ,Zheng DC,Chen YF）;Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China（Rao L）;Department of Dermatology,Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450002,China（Yu HH）

Chen Yongfeng,Email:gdcyf@163.com

Objective To investigatemicroRNA（miRNA）expression profiles in peripheral blood and skin lesions of patients with psoriasis vulgaris（PV）,and to seek miRNAs consistently expressed in peripheral blood and skin lesions.Methods AmiRNAmicroarraywas used to screen differentially expressedmiRNAs in skin lesionsand peripheralblood samples between 17 patientswith PV and 4 healthy human controls,and real?time fluorescence?based quantitative PCR（RT?qPCR）to verify the differentially expressed miRNAs.The correlations of these differentially expressedmiRNAswith psoriasis area and severity index（PASI）scorewere assessed by Pearson correlation analysis.Results The AgilenthumanmiRNAmicroarray profiling revealed 15miRNAs consistently expressed in skin lesions and peripheralblood of patientswith PV.Of the 15miRNAs,7were verified as consistently expressedmiRNAsby RT?qPCR.Among the 7miRNAs,the expression intensity ofmiR?30e?5p,miR?192?5p,miR?17?3p andmiR?1227?5p was negatively correlated with PASIscores（allP＜0.05）,while thatofmiR?125b?5p,miR?642a?5p andmiR?29a?5p was uncorrelated with PASIscores（allP＞0.05）.Conclusion SomemiRNAs are consistently expressed in skin lesions and plasmaof PV patients,which areexpected to serveasbiomarkers forevaluation ofpsoriasisseverity.

Psoriasis;MicroRNAs;Microchip analytical procedures;Gene expression profiling;Severity of illness index

陳永鋒，Email：gdcyf@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.11.07

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（A2011106）

Fund Program:GuangdongMedical Scienceand Technology Research Fund（A2011106）

2016?04?07）

（本文編輯：吳曉初）