6株光合細菌的分離及水質凈化效果的研究

劉樣珍　凌梅燕　史寶軍（1.清遠海貝生物技術有限公司，清遠511853；2.廣東海大集團海大研究院，廣州511400）

6株光合細菌的分離及水質凈化效果的研究

劉樣珍凌梅燕史寶軍
（1.清遠海貝生物技術有限公司，清遠511853；2.廣東海大集團海大研究院，廣州511400）

采用半固體試管法和厭氧培養法從對蝦養殖泥中富集篩選出6株光合細菌，分別編號為PSB-1、PSB-2、PSB-3、PSB-4、PSB-5、PSB-6，并對其降解水體氨氮、亞鹽、硫化物方面進行探討。結果表明，6株光合細菌對氨氮的最高降解率達到93.21%，對亞鹽的最高降解率達到99.84%，對硫化物最高降解率為50%。最終確定3株對3種有害物質均有降解效果的光合細菌，為后續復合菌株提供實驗依據。

光合細菌；氨氮；亞鹽；硫化物

隨著我國水產養殖的發展，高密度養殖規模日益擴大，養殖水體常因池中殘餌、水生生物排泄物及尸體等的腐爛、分解，導致水質惡化，使水體中營養元素N、P等發生非正常變化并產生氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有毒有害物質，致使養殖生態環境嚴重惡化。非離子態的氨氮對養殖對象可以直接產生毒性，影響其生長和發育。在養殖旺季，由于氣溫高，導致異氧微生物大量繁殖，有機物被分解，釋放出大量的氨，硫化氫等有害物質，從而影響魚蝦的生長、發育，引起魚蝦的疾病。光合細菌是一類以光為能源，能以自然界中有機物、硫化物等為營養，并能進行光作用的微生物，可將養殖池底由魚蝦排泄物、食物殘餌產生的氨氮等有毒物質有效的降解。本實驗從對蝦池塘底泥篩選獲取6株光合細菌，并探討6株光合細菌水體中有害物質的凈化作用，尋找能同時降解有害物質并具有協同作用的菌株，為降解養殖水體中的有害物質。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源

廣州市海鷗島對蝦養殖池塘

1.1.2儀器設備

顯微鏡（CX-31）、滅菌鍋、平板、pH計（pHS-3C）、紫外分光光度計（UV-1800）、低溫冷凍高速離心機等。

1.1.3培養基

分離培養基：CH3COONa·3H2O 2g/L、CH3CH2COONa 2g/L、NaCl 1g/L、NH4Cl 0.5g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.2 g/L、FeSO410 mg/L、酵母膏1 g/L、CaCl20.0057g/2L、Na2CO30.0315g/2L、瓊脂15g/L；

富集及擴大培養基：CH3COONa·3H2O 3g/L、NaCl1g/L、NH4Cl 0.5g/L、MgSO40.2g/L、KH2PO40.5g/L、FeSO40.01g/L、CaCl20.0028g/L、Na2CO30.0157g/L。

1.2方法

1.2.1樣品富集培養

將200mL滅菌后的富集培養基倒入三角瓶中，與底泥攪勻，加入滅菌的液體石蠟以隔絕空氣。置于溫度為28～32℃、光照為2 000～3 000 lux的條件下培養，當富集液顏色變紅時，取菌膜及富集液轉接入另一裝有富集培養基的100 mL鹽水瓶瓶中培養，接種量為5%～10%，如此轉接4～5次。

轉基因食品安全問題。2012年湖南轉基因大米試驗、孟山都轉基因玉米致癌風波，2013年“崔方論戰”事件，2014年恒大推出非轉基因廣告造勢活動等，一度將轉基因食品安全問題推上風口浪尖。所以，目前人們最大的關注點是轉基因食品的飲食安全以及生態安全。

1.2.2分離純化

根據富集液濃度用1 mL移液管取不同稀釋度的富集液液加到滅菌的試管中，后加入18～20 mL滅菌的40℃光合細菌分離培養基，瓊脂含量0.8%；培養基冷凝后上層加5 mL滅菌的45℃2.0%的瓊脂，用保鮮膜封口。冷卻后置于白熾燈下培養，培養溫度為30℃，光照強度為2 000～3 000lux，直至長出紅色單菌落。待單菌落長出后用厭氧培養法純化，劃線純化3～4次，鏡檢無雜菌后挑取紅色單菌落至10 mL液體培養基中培養，再逐步擴大培養。

1.2.3菌落及菌體形態觀察

以瓊脂平板上的菌落形態描述，菌體形態以電子顯微鏡描述。

1.2.4標準曲線的制作

PSB以10%的接種量接種后，從0～132h開始檢測PSB的OD值的變化情況，36 h前每隔6 h取樣檢測，36 h后每隔4 h取樣檢測變化情況。

1.2.56株PSB對水體中亞硝酸鹽、氨氮、硫化物的降解作用

試驗分別在水體中添加1g/L的亞硝酸鹽、氨氮及硫化物，實驗組投入10%的PSB，對照組不加PSB菌液，試驗設3個平行，4 d后測OD值，測定前先將PSB液10000 r/min，10 min離心取上清液測定OD值；

表1　分離菌株的形態特征

2　結果與分析

2.1富集分離

對蝦池塘底泥富集7～10天后，培養液變紅，重復富集,取呈深紅色的富集液進行稀釋,經多次半固體培養法和厭氧培養法獲得6株光合細菌，分別命名為PSB-1、PSB-2、PSB-3、PSB-4、PSB-5、PSB-6。

2.2菌體形態

2.36株光合細菌的生長曲線

圖1　PSB-1（1000×）　

圖2　PSB-2（1000×）

圖3　PSB-3（1000×）　

圖4　PSB-4（1000×）

圖5　PSB-5（1000×）　

圖6　PSB-5（1000×）

圖7為6株光合細菌的生長趨勢，從圖中可看出6株光合細菌的趨勢是一致的。0～6 h是為遲滯期，6～54 h是對數生長期，54～132 h是穩定期，部分菌株在102 h后出現衰亡。96 h菌株已進入穩定期，對各種有害物質的降解也趨于穩定，故選擇96 h作為檢測光合細菌降解有害物質的時間點。

圖7　6株光合細菌生長趨勢

2.4光合細菌對氨氮的降解

實驗結果表明，11株光合細菌對于培養基中的氨氮都有降解作用，其中PSB-4對氨氮降解能力最強，從401.2 mg/L降解到27.25 mg/L，降解率達到93.21%，其次是PSB-2對氨氮的降解率為58.68%，PSB-5和PSB-6對氨氮的降解率約為55%，PSB-1及PSB-3的降解率約為33%。

圖8　6株光合細菌接種4天后對氨氮的降解

2.5光合細菌對亞鹽的降解

由圖9可知，PSB-1和PSB-2對亞鹽的降解率為99.84%，PSB-3對亞鹽的降解率為 58.94%，PSB-5和PSB-6對亞鹽的降解率約為52%，而菌株PSB-4反而上升。

2.6光合細菌對硫化物的降解

從圖10可知，PSB-1對硫化物的降解率為50%，PSB-5對硫化物的降解率為44.95%，PSB-2和PSB-6對硫化物的降解低于20%，而PSB-3和PSB-4在接種當天快速地降解硫化物，而后又升高，其原因還需要進一步的實驗分析。

圖9　6株光合細菌接種4天后對亞鹽的降解

圖10　6株光合細菌對硫化物的降解

3　小結與討論

PSB的分離培養常采用厭氧培養法、雙層平板法和半固體試管培養法，光的波長和光照強度對于光合菌培養影響較大。本研究發現利用厭氧培養法篩選光合細菌的效果優于半固體試管法，該方法相對半固體培養法便于挑取單菌落制備液體種子，且比半固體培養法的培養周期短，可能與厭氧程度相關。

PSB不同菌株的生理功能差異較大。本實驗從池塘底泥及市售樣品中分離篩出6株光合細菌，PSB-3和PSB-4不具備降解硫化物的能力，其余均具有降解氨氮、亞鹽、硫化物的能力，其中PSB-1、PSB-2、PSB-5都具有較好的降解水體中有害物質的能力。通過對幾株光合細菌菌株的降解實驗分析，進一步組合復合菌株。劉敏等在研究混菌發酵對光合細菌生長及氮磷同化率指出糞紅假單胞菌自身生長能力較沼澤紅假單胞菌強，混菌培養后兩種光合細菌對培養基中氮磷的同化能力明顯增強，較對照組的沼澤紅假單胞菌同化率提高19.89%。

PSB-3及PSB-4對硫化物的利用出現升高的情況，劉磊等在研究光合細菌降解水體中硫化物出現含量升高的情況，原因可能與光合細菌抑制硫化物的作用機制有關，一是水體環境中硫酸鹽含量高，硫酸鹽的還原是H2S的主要來源。二是由于氧的供應不足，硫蛋白的分解過程產生了H2S。

（略）

S917.1

A

1005-8613（2016）09-0022-03

2016-8-29

劉樣珍，（1989-），女，廣東韶關，研發專員，主要從事微生態制劑研究。