基于TMCM-6110和LabVIEW的全自動酶聯免疫前處理儀的設計

萬 娟，張 莉，張冰洋，武 力，周 盟

（1.中南民族大學 檢測與儀器校級工程中心，武漢 430074；2.中南民族大學 生物醫學工程學院，武漢 430074；3.中南民族大學 實驗教學與實驗室管理中心，武漢 430074）

檢測與監控

基于TMCM-6110和LabVIEW的全自動酶聯免疫前處理儀的設計

萬 娟1，張 莉2，張冰洋3，武 力2，周 盟1

（1.中南民族大學 檢測與儀器校級工程中心，武漢 430074；2.中南民族大學 生物醫學工程學院，武漢 430074；3.中南民族大學 實驗教學與實驗室管理中心，武漢 430074）

依據酶聯免疫法工藝，我們設計了一款基于TMCM-6110和LabVIEW的全自動酶聯免疫前處理儀。采用SolidWorks三維軟件對儀器機械結構進行設計；自動控制部分以TMCM-6110為主控板控制步進電機、隔膜泵、蠕動泵和加熱片等執行單元；儀器操作界面采用LabVIEW開發，具有操作工序錄入、工作狀態監控、可供用戶自定義樣品處理流程等功能。該儀器實現了酶聯免疫法檢測的實驗室全自動化，具有機箱體積小、運行速度快、移液精度高、操作界面友好等特點，完全滿足中小型實驗室及社區醫院的樣本檢測需求，具有良好的市場前景。

樣品前處理；酶聯免疫法；SolidWorks；TMCM-6110；LabVIEW

0　引言

酶聯免疫測定法（ELISA）相較于高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）、液相色譜質譜串聯分析技術（LC-MS/MS）等檢測方法而言，具有靈敏度高、反應時間短、特異性強、樣品量小、污染小、回收率高、重現性好等特點，能有效的測定酶和抗體活性、結合物中酶含量和免疫球蛋白含量、酶與免疫球蛋白摩爾比值以及結合率［1］。

酶聯免疫測定法（ELISA）現已成功地廣泛應用于生物分析、檢驗檢疫、醫學分析領域，尤其在體液檢測領域中發揮重要作用。目前，國內大多數中小型分析檢測實驗室和縣區級醫院主要采用手工操作來完成酶聯免疫測定法實驗，費時費力，效率低，且難以保證檢測結果的準確性；少數機構采用自動化的酶聯免疫分析儀，多為進口儀器，價格昂貴，體積龐大，能耗高，全英文操作界面過于復雜，不易操作。而“十三五”規劃綱要指出，深化醫藥衛生體制改革，實行分級診療，讓優質醫療設備進入縣區級醫院，提高基層醫療服務水平，降低醫療費用，從而中小型醫院對酶聯免疫前處理儀這類檢測分析儀器的需求將大幅提高。這類醫院進行體液檢測時，要求分析檢測儀器移液精度高，能耗低，中文操作界面易用性強。

針對這樣的市場需求，我們集酶聯免疫分析技術、機械設計、光電傳感、步進電機控制、軟件技術于一體，設計了一款體積小，精度高，可靈活選擇板孔，中文操作界面簡單人性化的全自動酶聯免疫前處理儀，實現了酶聯免疫前處理的自動化，提高分析檢測實驗室的檢測效率和檢測結果的準確性，同時，價格適中，具有良好的市場前景。

1　基本原理

酶聯免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA），是一種在免疫酶技術基礎上，發展起來的一種新型的免疫測定的方法，用于檢測體液中的微量物質。該方法將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結果［2］。在體液檢測中，雙抗體夾心法是檢測血液中抗原含量的最為常用的方法，也是課題組研制儀器運行方案的主要依據之一，如圖1所示，儀器運行方案主要有以下七個步驟：

1）加溶劑操作：使待檢抗原對應的抗體與固相載體結合，合成固相抗體。

2）洗滌操作：反復洗滌，除去1）未結合的其他物質。

3）加溶劑操作：加入待檢樣本，充分接觸反應之后，樣本中的抗原與固相載體相結合，形成固相抗原復合物［3］。

4）洗滌操作：通過洗滌，除去3）未結合的其他物質。

5）加溶劑操作：加入酶標抗體，使之與固相抗原復合物中的抗原相結合。

6）洗滌操作：通過洗滌，除去5）未結合的其他物質。

7）加溶劑操作：加入底物，與酶發生反應，產生有色化合物。根據顏色的深淺來判斷待檢標本中抗原的量。

圖1　酶聯免疫法基本原理

2　系統總體設計

全自動酶聯免疫前處理儀主要由機械和電控兩部分構成。機械部分主要由整體機架、X軸載動系統、Z軸載動系統、移液系統、振蕩部件及工作臺等零部件組成。課題組依據酶聯免疫法實驗的工作流程（加試劑、恒溫振蕩孵育、洗板）來完成儀器的整體布局，將工作臺分為四個工位，分別是槍頭盒、溶劑盒、廢槍頭盒、振蕩盒，機械結構的設計由SolidWorks三維軟件完成。

儀器的電控部分由TMCM-6110主控板、步進電機、電機驅動器、光電傳感器、數字溫度傳感器、加熱器、繼電器、隔膜泵、蠕動泵等部件組成。儀器工作時，控制系統驅動電機帶動相關部件，實現精準定位，完成自動裝卸槍頭，定量吸、排試劑，吸、排洗滌液，定時恒溫振蕩等工序，從而完成選定的操作流程。其結構框圖如圖2所示。

3　控制系統設計

3.1傳動控制系統的設計

全自動酶聯免疫前處理儀主要目的是完成特定抗體、固相載體、酶標抗體、底物與樣品在特定溫度下振蕩孵育后，反應生成有色產物的過程。這個過程主要依靠傳動系統對固定在機械臂上的8通道洗針、移液槍頭進行精準定位，確保儀器可以準確地運動到槍頭盒、溶劑盒、酶標板的上方，完成相關動作。此需求的主要原因有三方面：1）8通道移液器自動裝卸一次性標準槍頭，在上槍頭時，需要移液器對準工作臺的槍頭盒工位（X軸位移誤差在0.1mm之內移液器才能精準牢固地裝載槍頭）；2）儀器在抽試劑時，槍頭必須對準試劑盒工位，保證槍頭在試劑盒的正中間，插入一定的深度，才能確保吸液動作地正常完成；3）洗板時，洗針移動到96孔板的每一排，洗針精準地插入相應板孔，X、Y軸坐標尤為關鍵。基于此，傳動硬件控制系統主要選用Trinamic Motion Control GmbH制造的TMCM-6110主控板、雷塞57系列的兩相步進電機、EE-SX672光電傳感器。

TMCM-6110的主控芯片為STM32，其集成6軸步進電機控制和驅動于一體，每軸電機自帶一組左右限位輸入，6路數字量的輸出（1A），供電電壓為24V。其主要特點是，使用最新的Coolstep技術和stallguard丟步檢測技術，電機電流可隨電機的負載動態調節，在節能的情況下實現電機的大力矩輸出和高速運轉，防止因力矩不夠而產生的丟步。實驗證明，TMCM-6110主控板控制電機帶動傳動系統的定位精準度完全能夠滿足儀器對定位系統的要求。

圖2　系統結構框圖

雷塞57系列兩相步進電機為一個執行單位，其步距角為1.8℃，額定電流3A，電源電壓為12V～24V。采用了細分方式來解決步進電機低頻振動大、噪音大的問題［4］，根據不同的電機載動情況，設置不同的細分參數［5］。TMCM-6110直接控制電機的運轉，電機驅動芯片TMC260每輸入一個脈沖，電機運行一個步距角，電機帶動負載運動，從而實現傳動系統的位置控制功能。電機驅動圖如圖3所示。

圖3　電機驅動圖

為實現傳動系統的精準定位和零點設置功能，選用歐姆龍微型EE-SX672光電傳感器，安置于X軸、Z軸、移液器的零點位置。設置零點之后，便于對傳動系統設置固定的位置坐標，利于相關部件的移位操作。EE-SX672的應答頻率為1kHz的高速響應，電源電壓為DC5～24V，采用NPN集電極開路輸出模式，常閉，負載電流在40mA～100mA，傳感距離為5mm。因電源存在沖擊電壓，在光電傳感器的電源正負極之間并聯一個齊納二極管吸收緩沖電壓。本系統采用開關電源24V電壓供電，主控板TMCM-6110有六路Reference switch connectors，其輸入電壓為+5V。為保證光電開關輸出信號穩定，OUT端外接一個1kΩ的電阻上拉至+5V電壓端。位置檢測電路如圖4所示。

圖4　位置檢測電路

3.2移液控制系統的設計

酶聯免疫前處理儀研發的重點是8通道移液器的移液精度。經過市場調研之后，本儀器的移液范圍設計在10～200μl。移液器由上槍頭部件、脫槍頭電機、移液電機、移液針管等組成，主要是靠TMCM-6110給移液電機發送脈沖信號帶動移液器的活塞運動，通過吸筒抽取定量的試劑。為控制移液器的運行速度及平穩性，對移液電機的細分參數、最大加速度、最大位移速度進行相應的設置。脈沖數和試劑之間的公式為：

式中，X為脈沖數，V為試劑容量，K為絲桿單位長度位移對應的脈沖數，r為活塞桿的內半徑。

3.3溫度控制系統

在酶聯免疫法實驗過程中，酶標抗體與樣本反應、顯色反應等都要求在一定溫度恒溫孵育振蕩。例如酶聯免疫法測乙肝病毒，樣本與酶標抗體的反應要求在37℃恒溫務件下振蕩完成。

在本儀器中，為避免模擬電路設計中的引線誤差補償、信號調理誤差等一系列問題，溫控模塊主要采用SRND-CM-DS18控制板控制加熱片和DS18B20溫度傳感器［6］，來實現孵育振蕩時的溫度控制功能［7］。SRNDCM-DS18控制板選用RS485與上位機通信，波特率設置為9600，4路AI端，4路繼電器，24V電源供壓。通過接受上位機發出的指令，反饋傳感器獲取的溫度值，控制指定繼電器的開關。SRND-CM-DS18控制板在本儀器中，主要負責溫度的讀取和控制加熱片，測溫范圍是-55℃～125℃，溫度精度±0.5℃，溫度分辨率為0.1℃。

圖5　下位機軟件結構

4　軟件系統設計

系統軟件與硬件電路密切結合是實現儀器正確穩定運行的必要務件。本儀器集機械自動化與計算機實時狀態監控和數據存儲分析于一體，要求其下位機能夠穩定準確地執行上位機發出的指令，上位機實時處理收發數據，顯示下位機的運行狀態。基于此，課題組提出系統軟件設計方案，軟件系統分為上位機軟件系統和下位機軟件系統。

4.1下位機軟件系統設計

在主控板TMCM-6110上運行的軟件即為下位機軟件，在其對應的開發平臺上采用TMCL語言開發。下位機軟件的主體設計思想主要是總分思想，按功能分為五大模塊：

1）參數設定：依據每個電機負載情況及運行速度要求，設定每個電機的細分參數、最大位移速度、最大走位置速度等參數。

2）歸零：每次儀器上電，每個軸自動歸零點。保證儀器每次開機在初始狀態。

3）溶劑操作：首先，移液器運行到槍頭盒工位上方，裝載指定槍頭；移動到溶劑盒工位上方，抽取指定溶劑；移動到酶標板上方，排放溶劑；移動到脫槍頭工位，卸掉槍頭。

4）振蕩孵育：實時獲取溫度，當實際溫度在設定值時，開始振蕩，小于設定值時，啟動加熱片加熱。

5）洗板：通過控制隔膜泵和蠕動泵，清洗酶標板的指定排。

其下位機軟件結構如圖5所示。

4.2上位機軟件系統設計

在PC機上運行的軟件即為上位機軟件，基于LabVIEW圖形化編程開發平臺，采用485串口通信的方式設計出人性化的人機交互界面。

上位機軟件主要實現以下三大功能：1）串口通信功能：依據485通信協議經由USB轉485串口線與下位機進行通信，依據選定流程發出相應指令，控制TMCM-6110和溫控模塊，使各部件完成相應動作。2）人機界面友好交互功能：用戶可依據自身實驗要求，來自主設定試劑編號、試劑體積、振蕩時間、振蕩溫度、洗板次數和動作先后順序，實時顯示下位機的運行狀態。3）數據處理存儲功能：上位機軟件分析處理存儲用戶設定的參數，以及從下位機接收的數據。

上位機軟件設計主要由以下六大模塊組成：1）板孔設置：用戶選定96孔酶標板來添加溶劑，逐行選定，避免整板添加浪費時間和材料。2）參數設置：分為試劑設置、振蕩孵育設置、洗板設置。試劑設置主要是選定試劑編號和試劑體積，試劑編號一共有六種，分別對應下位機工作臺試劑盒工位上的六個試劑位置，體積單位為微升；振蕩孵育設置是選定振蕩時間和溫度；洗板設置是選定洗板次數。3）處理流程設置：將用戶設定的參數反映到表格中，便于直觀的反應用戶選定的實驗流程。同時，具備上移、下移、刪除、清空、保存、執行等功能鍵，便于用戶更改保存實驗流程。在下位機運行時，會以深色選中框來顯示正在執行的流程。4）處理流程存儲：將處理流程設置模塊中的流程編號、命名、存儲。5）串口通信、流程執行模塊：采用485串口通信的方式，選擇串口，與下位機連接通信，收發指令；流程執行按鈕控制實驗的開始、結束。6）下位機狀態監測：通過文字窗口，實時顯示下位機正在執行的操作。其上位機軟件框圖如圖6所示。

圖6　上位機軟件框圖

5　儀器性能分析

全自動酶聯免疫前處理儀（1臺）經檢測，其安全性能指標都符合業界標準。采用稱重法對儀器的重復性精度、線性精度、工作相對穩定性和通道均一性進行了測試。

表1　測試數據

樣品為純水，室溫23℃，選30、60、90、120、150μl（儀器的取樣范圍在30～160μl）五組，每組加十個樣品，加樣后在精密天平上稱重，再換算成容積。測量數據如表1所示。

1）重復性精度

這里取純水的密度為1g/mL，由表1易得出每組的平均移液量、標準方差σ、重復性精度CV、絕對誤差、相對誤差。數據處理結果如表2所示。

由表2可知，儀器移液的重復性精度最大為3.02%，最小為0.49%；移液相對誤差為2μl，絕對誤差在6.7%～1.3%；目標移液量越大，CV值越小，重復性精度越高，相對誤差越小，準確度越高。重復性精度在5%以下，相對誤差在7%以下，符合酶聯免疫法實驗的要求。

表2　重復性精度測試結果

2）線性精度

由圖7可知，移液量的線性方程為y=30.2x-1.16。式中，y為實際移液容積，x為目標移液容積。圖7說明，實際移液容積量具有線性相關性。

圖7　移液線性精度曲線圖

3）均一性

圖8為移液量為130μl和65μl的情況下，儀器自動上槍頭吸取純凈水所得的均一性曲線。由圖可知，在130μl時，儀器的移液相對標準偏差（RSD）為0.3829；在65μl時，儀器的移液相對標準偏差（RSD）為0.2476。8通道移液槍的均一性較好，符合酶聯免疫法實驗的要求。

儀器的各項性能指標如下：

（1）加熱范圍：室溫～100℃；

（2）處理試劑容量：30～160μl；

（3）加熱模塊溫度均勻度：±1℃；

（4）移液重復性精度：±4%；

（5）移液相對標準偏差（RSD）：0.2476。

（6）移液均一性：±3μl；

圖8　通道移液均一性曲線圖

6　結束語

我們設計的全自動酶聯免疫前處理儀，上位機中文操作界面友好，可操作性強，可實時顯示下位機的運行狀態；實現高通量、高效率、無污染的樣品前處理。實驗結果表明，該儀器能夠達到酶聯免疫法體液檢測實驗的各項性能要求，移液精度高，耗時短，運行穩定，安全可靠。儀器整體體積小，價位適中，工位劃分細致，便于維修，適用于中小型實驗室和縣區級醫院，具有良好的市場前景。

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The design of fully automatic ELISA pretreatment instrument based on TMCM-6110 and LabVIEW

WAN Juan1， ZHANG Li2， ZHANG Bing-yang3， WU Li2， ZHOU Meng1

TP29

B

1009-0134（2016）10-0001-06

2016-05-26

國家自然科學基金資助項目（81101080）

萬娟（1992 -），女，湖北人，碩士研究生，研究方向為醫療儀器設備的研發與設計。