靶向納米材料作為大鼠單個核細胞基因載體的研究*

董亞賢，堯慧燕，梁　兵，鐘高賢，刁芳明，石紅婷

(廣州醫科大學　1.附屬第一醫院神經內科；2.附屬第四醫院神經內科；3.附屬第二醫院神經內科，廣東　廣州　510000)

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靶向納米材料作為大鼠單個核細胞基因載體的研究*

董亞賢1，堯慧燕2，梁兵3，鐘高賢2，刁芳明2，石紅婷2

(廣州醫科大學1.附屬第一醫院神經內科；2.附屬第四醫院神經內科；3.附屬第二醫院神經內科，廣東廣州510000)

目的:探討納米材料聚乙二醇-聚乙烯亞胺(PEG-PEI)作為基因載體的可行性研究，研究其負載質粒DNA(pDNA)的能力，分析所形成納米材料/pDNA復合物的特性，以及體外對細胞的毒性大小及其轉染效率。方法:以PEI為對照，合成PEG-PEI，采用MTT法檢測所形成納米材料/DNA復合物對大鼠單個核細胞(PBMC)的細胞毒性，再采用倒置熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測轉染效果。結果:N/P<10時，PEG-PEI和PEI的存活率分別為82.7%及81.3%(P﹥0.05)；N/P=10時，PEG-PEI是81%，PEI為59% (P<0.05)；N/P﹥10時，PEG-PEI的細胞存活率比PEI低(P<0.05)。N/P=10時，用倒置熒光顯微鏡觀測PEG-PEI較PEI表達的綠色熒光多，熒光強度大(P<0.05)；同時利用流式細胞儀檢測PEG-PEI和PEI的轉染效率，分別為28.9%和12.5%(P<0.05)。結論:納米材料PEG-PEI具有強的負載能力，轉染效率高，細胞毒性低的優點，為作為多發性硬化基因載體的可行性奠定了實踐基礎。

納米材料；PEG-PEI；體外基因轉染

多發性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一種慢性、炎癥性、脫髓鞘的中樞神經系統疾病[1-2]。目前免疫調節治療是治療MS的主要策略，但免疫治療并沒有使用針對MS病理上存在變性、壞死的神經保護治療，因而療效差、預后差[3]。因此，非常有必要進一步探討能促進神經軸突和髓鞘再生的有效治療MS的方法。近年來隨著分子生物學與基因工程技術的發展，多發性硬化的轉基因治療研究取得了一定的進展。然而基因治療中最關鍵的是將質粒DNA導入細胞中，而后進入細胞核，單純質粒DNA很難直接進入細胞，從而高效、安全的基因傳輸載體也是關鍵因素[4-5]。本文旨在合成聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)-聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)，并研究其負載質粒DNA(pDNA) 的能力，同時在體外檢測了其細胞毒性和轉染效率，評估PEG-PEI的基因轉染效率及細胞毒性作用, 為尋找嶄新的、行之有效的基因治療方法打下理論和實踐基礎。

1　材料與方法

1.1實驗試劑大鼠單個核細胞(PBMC)購自美國ATCC公司，DMEM培養基購自Invitrogen公司，質粒小提試劑盒購自日本BioFlux公司。其余大多數化學試劑，包括PEI、PEG、MTT均從美國Sigma公司購買，PEG-PEI本實驗自備而成。

1.2質粒DNA(pDNA)的制備本研究應用能表達綠色熒光蛋白的pAAV-EGFP。質粒在宿主菌大腸桿菌DH5α株中擴增，然后用BioFlux的質粒提取試劑盒提取純化。得到的質粒通過紫外分光計在260 nm和280 nm波長處檢測其純度，然后在1.0%的瓊脂糖凝膠上以100 V電壓電泳40 min，檢測其完整性。檢測合格的質粒保存于-20 ℃備用。

1.3細胞來源及培養大鼠單個核細胞由本實驗室保存。用加有10%FBS和1%抗生素(青霉素/鏈霉素)的DMEM培養基在5%CO2培養箱37 ℃中培養。

1.4PEG-PEI/質粒DNA復合物的制備在Eppendorf管中，將1 μg pDNA稀釋在50 μ0不含FBS的DMEM中，振蕩均勻，按不同N/P比把相應量的納米材料加入到另外一管裝有50 μ0不含FBS和抗生素的DMEM的Eppendorf管中混勻，靜置約5 min后把兩溶液混合，在室溫下用漩渦振蕩器低速振蕩5 min得到均勻復合物，37 ℃靜置30 min以保證pDNA與納米粒的充分結合。

1.5聚合物粒徑和zeta-電位的測量納米材料和pAAV-EGFP按不同N/P(N/P是指陽離子聚合物中的NH4+與DNA中的PO3-摩爾比例)比在37 ℃下混合振蕩30 min復合后，在ZetaPALS-電位分析儀上測定，條件為25 ℃，入射光波長為625 nm。

1.6瓊脂糖凝膠電泳PEG-PEI和PEI分別配制成一系列不同濃度的磷酸緩沖溶液,納米粒子溶液與pDNA按N/P比為0、0.5、1、5、10、20、30和40漩渦震蕩復合后, 室溫靜置30 min。上樣前和6倍的瓊脂糖染色劑結合,上樣到含有溴化乙錠EB(0.1 μg·mL-1)的1.0%瓊脂糖膠板上，在PBS中以100 V的電壓電泳40 min，通過紫外燈觀測結果并攝片記錄。

1.7細胞毒性檢測(MTT法)MTT法具體實驗過程如下：PBMC細胞以每孔6 000個細胞接種在96孔板中；按不同的N/P分別為5、10、20、30計算出相應的納米材料濃度，24 h后每孔加入150 μL 含150 ng 質粒DNA的納米材料/pDNA復合物的不含血清培養液進行轉染，每個N/P濃度復設四個復孔，48 h之后加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，繼續培養4 h，小心吸出孔內培養上層清液后，加入100 μL DMSO，室溫振蕩5 min后，通過化學發光酶標儀測定在570 nm處的吸光值(OD值)。細胞活性(%)=(實驗組OD值均值-調零組OD值均值)/(對照孔OD值均值-調零組OD值均值)×100%。

1.8細胞轉染效果實驗將細胞以1×105細胞每孔接種在24孔板上培養24 h，待細胞匯合度為70%，在轉染前4 h用200 μL不含FBS或含FBS的DMEM培養基置換培養液，把其吸走后每孔加入含有2 μg pDNA不同N/P比的PEG-PEI /質粒和200 μL不含FBS或含10%FBS的DMEM培養基，在37 ℃下培養4 h，吸去轉染液，加入完全DMEM培養基在37 ℃下二氧化碳培養箱中繼續培養24 h。pAAV-EGFP同納米材料復合后對PBMC細胞轉染后，棄去上層培養液，采用倒置熒光顯微鏡觀測轉染結果，并采用流式細胞術檢測轉染效率。

2　結　果

2.1納米材料復合物的粒徑和zeta-電位如圖1所示，在ZetaPALS電位分析儀上測定PEG-PEI/ pDNA和PEI/ pDNA的粒徑和zeta-電位，PEG-PEI和PEI納米復合體粒徑隨著N/P從1到30的增大而減小，表面電荷隨著N/P從1到30的增大而增大，同時在同一N/P下PEG-PEI/ pDNA較PEI/pDNA粒徑大，而電荷相對較低，結果表明PEG-PEI/pDNA結合的比較好。

圖1PEI與PEG-PEI在不同的N/P比下形成納米復合體后的粒徑和zeta-電位

2.2瓊脂糖凝膠電泳如圖2所示，右圖為對照組PEI的pDNA結合能力，發現在N/P比值為0.5以上時，泳動才能被完全阻滯。左圖為PEG-PEI/pDNA結合后的電泳結果，發現當N/P=0.5時，PEG-PEI就完全結合pDNA。上述結果提示PEG-PEI與pDNA的結合能力較對照組PEI的更強，并有利于基因的轉染。

圖2PEI與PEG-PEI在不同的N/P比下形成復合物后的瓊脂糖凝膠電泳結果

2.3細胞毒性檢測結果從圖3可以得出，在PBMC細胞中，N/P<10時PEG-PEI/pAAV-EGFP和PEI /pAAV-EGFP的存活率相當；N/P=10時PEG-PEI/pAAV-EGFP是81%，比PEI/pAAV-EGFP(59%)的細胞存活率要高(P<0.05)；N/P﹥10時PEG-PEI/pAAV-EGFP的細胞存活率比PEI /pAAV-EGFP低(P<0.05)。顯示在N/P=10時，PEG-PEI作為基因治療載體有很大的優勢。

圖3PEI與PEG-PEI形成復合物后在PBMC細胞中的細胞毒性

2.4細胞轉染結果在PBMC細胞中，用倒置熒光顯微鏡觀測N/P=10時PEG-PEI/pAAV-EGFP復合物表達的綠色熒光多，熒光強度大，因此提示PEG-PEI的轉染效果較PEI好，差異有統計學意義(P<0.05，圖4)。同時利用流式細胞儀檢測N/P=10時PEG-PEI/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP在PBMC細胞的轉染效率，同樣發現PEG-PEI/pAAV-EGFP的轉染效率最好，為28.9%；PEI/pAAV-EGFP 為12.5%，結果比較差異有統計學意義(P<0.05，圖5)。

N/P=10

注：采用倒置熒光顯微鏡觀察PEI/pDNA和PEG-PEI/pDNA

在N/P比=10時轉染PBMC細胞后的熒光細胞表達。

圖4PEI與PEG-PEI形成復合物后在PBMC細胞中的綠色熒光蛋白表達水平

注：在N/P=10時，通過流式細胞儀檢測PEI/pDNA和PEG-

PEI/pDNA的轉染效率。

圖5PEI與PEG-PEI形成復合物后在PBMC細胞中的轉染效率

3　討　論

在基因治療研究領域，載體是至關重要的問題，因此安全高效的基因載體是實現基因治療的關鍵因素[6-7]。國內外相關研究報道[8-9]PEI的DNA親和性好，有利于DNA的復合及凝集，并利用PEI的“質子海綿”功能，納米粒子在酸性溶酶體內可以迅速地發生分子鏈構象變化，產生較強的滲透壓而破壞溶酶體并釋放自由DNA。另外，PEG可以屏蔽正電荷而降低載體的陽離子毒性，同時它還能提高納米粒子在血液中的穩定性、增強載體對DNA分子的保護作用而使DNA在傳輸過程中不被酶降解、延長聚合物-DNA納米粒子的體內循環時間，這些因素有利于獲得更好的基因傳輸效率。因此本實驗合成并體外檢測了PEG-PEI的理化特性、毒性和靶向傳輸及轉染能力。

本實驗考慮到由于粒徑和zeta-電位是衡量復合物結合細胞能力進入細胞的重要參數，從而合適的粒徑和表面電荷將有助于復合物通過有效的途徑進入細胞膜。因此我們通過Zeta電位儀研究復合物的粒徑和表面電荷，本研究發現同一N/P下PEG-PEI/pDNA較PEI/pDNA粒徑大，而電荷相對較低，結果顯示PEG-PEI/ pDNA結合的比較好。

相關研究曾證實[10]因為核酸分子帶負電荷，當加入陽離子聚合物時，隨著聚合物含量的增加，會出現電中和甚至反轉從而使DNA向電場陽極泳動阻滯的現象，因此我們可以通過瓊脂糖凝膠電泳來確定陽離子載體與DNA的相互作用。本研究所示，當N/P=0.5時，PEG-PEI就完全結合pDNA，而對照組PEI，發現在N/P比值為0.5以上時，泳動才能被完全阻滯。上述結果提示PEG-PEI較對照組PEI有更強的pDNA結合能力，從而提高基因轉染能力。

基因載體的轉染效率與納米材料或者復合體的細胞毒性相關，如果復合物的毒性高，則相應的轉染表達水平也可能會下降[11]。我們發現在PBMC細胞中，N/P<10時PEG-PEI/pAAV-EGFP和PEI /pAAV-EGFP的存活率相當，N/P=10時PEG-PEI/pAAV-EGFP比PEI/pAAV-EGFP的細胞存活率要高，而N/P﹥10時PEG-PEI/pAAV-EGFP的細胞存活率比PEI /pAAV-EGFP低，說明納米材料在改造后同樣用量的時候毒性大大降低了。同時本研究采用熒光顯微鏡及流式細胞儀衡量復合物在PBMC細胞中轉染效果。我們觀測到N/P=10時PEG-PEI/pAAV-EGFP復合物表達的綠色熒光較多，熒光強度更大，因此提示PEG-PEI的轉染效果較PEI好，另外流式細胞儀檢測結果也證實了同樣的結果。

綜上所述，本研究明確了PEG-PEI的基因轉染效率及細胞毒性作用,同時證實PEG-PEI各方面的性能都優于PEI，從而提示我們PEG-PEI可以作為PBMC細胞基因傳輸的載體。

[1]孫博，李呼倫.在多發性硬化的免疫病理過程中不同免疫細胞的作用[J].中國免疫學雜志,2015,31(12)：1585-1590.

[2]劉路，杜芳騰，文藝，等.RLRs 治療多發性硬化癥的研究進展[J].天津醫藥,2016,44(1)：117-120.

[3]Raphael I,Nalawade S,Eagar TN,et al.T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases[J].Cytokine,2015,74(1):5-17.

[4]Deng JJ,Li N,Mai KJ,et al.Star-shaped polymers consisting of a beta-cyclodextrin core and poly(amidoamine) dendron arms:binding and release studies with methotrexate and siRNA[J].Journal of Materials Chemistry,2011,21(14):5273-5283.

[5]Bardi G,Malvindi MA,Gherardini L,et al.The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance[J].Biomaterials,2010,31(25):6555-6566.

[6]Guo X,Huang L.Recent advances in nonviral vectors for gene delivery[J].Acc Chem Res,2011,45(7):971-979.

[7]Obata Y,Ciofani G,Raffa V,et al.Evaluation of cationic liposomes composed of an amino acid-based lipid for neuronal transfection[J].Nanomedicine:nanotechnology, biology,and medicine,2010,6(1):70-77.

[8]謝黎崖，胡權，吳永良，等.葉酸和聚乙二醇雙修飾的殼聚糖納米粒的制備及其性能表征[J].中國現代應用藥學，2013,30(3)：284-289.

[9]Liang C,Yang Y,Ling Y,et al.Improved therapeutic effect of folate-decorated PLGA-PEG nanoparticles for endometrial carcinoma[J].Bioorganic & medicinal chemistry,2011,19(13):4057-4066.

[10]Shuai X,Merdan T,Unger F,et al.Novel biodegradable ternary copolymers hy-PEI-g-PCL-b-PEG:synthesis, characterization, and potential as efficient nonviral gene delivery vectors[J].Macromolecules,2003,36(15):5751-5759.

[11]Martin-Montanez E,Lopez-Tellez J F,Acevedo M J,et al.Efficiency of gene transfection reagents in NG108-15,SH-SY5Y and CHO-K1 cell lines[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol,2010,32(5):291-7.

A Study of Targeted Nano Materials as PBMCs Gene Vector

DONGYan-xian1,YAOHui-yan2,LIANGBing3,ZHONGGao-xian2，DIAOFang-ming2，SHIHong-ting2

(1.Dept.ofCerebrovascular,TheFirstAffiliatedUnionHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangdongGuangdong510150;2.Dept.ofCerebrovascular,TheForthAffiliatedUnionHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouGuangdong511447;3.Dept.ofCerebrovascular,TheSecondAffiliatedUnionHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangdongGuangdong510000)

Objective: To investigate the feasibility of targeted nanoparticles as gene vector, we synthesized polyethyleneglycol polyethylenimine(PEG-PEI)，and studied its capability of carrying plasmid DNA, analyzed its characterization as nanoparticle/DNA complex, assessed its cytotoxicity in vitro and measured its transfection efficiency. Methods: using PEI as control, we first developed PEG-PEI, and tested its cytotoxicity to the rat PBMCs via MTT assay. The transfection efficiency of the nanoparticle/DNA complex was also measured by EGFP immunofluorescence and flow cytometry. Results: When the N/P <10, the viability of PEG-PEI and PEI transfected cells were 82.7% and 81.3% respectively (P﹥0.05); when the N/P =10, the viability of PEG-PEI transfected cells was 81%, but that of PEI transfected cells was 59% (P<0.05); similarly, when the N/P﹥10, MTT assay results showed that the toxicity of the PEG-PEI was lower than PEI (P<0.05). The EGFP intensity of PEG-PEI (N/P =10) was much higher than PEI(N/P =10,P<0.05)assessed by inverted microscope fluorescence observation method；the flow cytometry results also showed that the transfection efficiency of PEG-PEI (N/P=10) and PEI(N/P=10) was 28.9% and 12.5%, respectively (P<0.05). Conclusion: The nanopaticle (PEG-PEI) exhibited lower toxicity and higher transfection efficiency, and therefore is the more suitable transfection carrier for gene therapy for multiple sclerosis.

Nano materials;PEG-PEI; In vitro gene transfer

廣東省自然科學基金(批文號：S2013010011760)

R285.5

A

1001-5779(2016)03-0343-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.003

2016-01-26)(責任編輯：敖慧斌)