miR-155調控Wnt/β-catenin信號通路與IgAN腎小管間質纖維化的關系*

葉偉標，李　儀，劉　濤，王　珍，李仲均，黃素然

(1.南方醫科大學附屬東莞人民醫院，廣東　東莞　523059；2.廣東省人民醫院，廣東　廣州　510080)

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miR-155調控Wnt/β-catenin信號通路與IgAN腎小管間質纖維化的關系*

葉偉標1，李儀1，劉濤2，王珍1，李仲均1，黃素然1

(1.南方醫科大學附屬東莞人民醫院，廣東東莞523059；2.廣東省人民醫院，廣東廣州510080)

目的:檢測miR-155在IgA腎病(IgAN)中的表達，探討其與患者臨床病理參數的相關性及可能作用機制。方法:應用實時熒光定量PCR檢測腎活檢組織中miR-155的表達水平；利用脂質體介導miR-155 mimics瞬時轉染人腎近曲小管上皮細胞(HK-2)，通過RT-PCR和Western blot檢測β-catenin、snail、fibronectin、E-cadherin的表達情況。結果:miR-155在IgAN組腎活檢組織中的表達水平顯著高于對照組(P<0.01)；腎活檢組織中miR-155表達量與腎小管間質纖維化呈正相關關系，與腎小球濾過率呈負相關關系；體外細胞實驗顯示，上調miR-155表達可激活Wnt/β-catenin信號通路，間質表型標志物fibronectin表達升高，而上皮表型標志物E-cadherin表達下降。結論:miR-155的表達上調與IgAN腎小管間質纖維化密切相關，其可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路參與IgAN的進展。

miR-155；Wnt/β-catenin；IgA腎??；腎小管間質纖維化

IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)是我國最常見的腎小球疾病之一。根據腎活檢統計數據顯示，IgAN約占原發性腎小球腎炎的45.3%～54.3%[1]。IgAN的臨床表現、治療反應和預后均存在較大的個體差異，臨床上約有30%～50%的患者在確診后的5～25年內進展為終末期腎臟病，給家庭和社會造成沉重的負擔。腎小管間質纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎臟病的共同通路。因此，研究IgAN腎小管間質纖維化的發生機制具有重要的現實意義。microRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中的內源性非編碼單鏈小分子RNA，可通過與靶mRNA互補結合，對靶基因進行轉錄后調控。近年的研究發現，miRNA在細胞分化、免疫應答、炎癥反應等多種病理生理過程中起重要作用。miR-155在IgAN中的表達及其作用尚未明確。本研究采用實時熒光定量RT-PCR檢測IgAN腎活檢組織中miR-155的表達情況；通過轉染miR-155模擬物，觀察miR-155對人腎近曲小管上皮細胞株Wnt/β-catenin信號通路及下游基因表達的影響，探討miR-155在參與IgAN腎小管間質纖維化中的可能機制。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1臨床標本選取2014年6月至2015年6月期間在南方醫科大學附屬東莞人民醫院腎內科住院并經臨床和腎活檢確診為原發性IgAN患者37例，收集腎活檢石蠟存檔標本。入選的病例均已排除系統性紅斑狼瘡、過敏性紫癜、乙型肝炎病毒相關性腎炎等繼發性IgAN。選取因腎腫瘤行腎切除術患者16例，用18號穿刺針留取距離腫瘤>2 cm處的腎組織作為正常對照。

1.1.2細胞株人腎近曲小管上皮細胞系HK-2購自中國科學院細胞庫。

1.2方法

1.2.1資料收集及病理評估收集患者年齡、性別、體重、血壓、24小時尿蛋白定量(UPE)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)等臨床資料。采用改良簡化MDRD方程[2]計算腎小球濾過率(eGFR)。腎活檢組織經固定及包埋切片后常規行光鏡、免疫熒光和電鏡檢查。參照文獻報道的方法[3]，對腎小管間質纖維化程度進行量化評估。

1.2.2miR-155表達水平的檢測石蠟包埋腎穿刺組織5 μm厚度切片5張，使用miRNeasy FFPE Kit(Qiagen)提取并純化miRNA。應用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit (TIANGEN)將miRNA逆轉錄為cDNA；使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit(TIANGEN)進行實時定量PCR。miR-155上游引物序列為5’-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3’；U6上游引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’。PCR反應條件如下：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性20 sec，60 ℃退火、延伸34 sec，共35個循環。

1.2.3細胞培養和轉染人腎近曲小管上皮細胞HK-2用含10%胎牛血清的DMEM/F12(GIBCO)培養基在37 ℃、5%CO2條件下培養。每2～3天更換培養液。待細胞生長至70%～80%融合時進行傳代。取對數生長期的細胞以2×105·孔-1的密度接種于6培養孔板中，使用LipofectamineTM2000試劑將miR-155 mimics(miR-155組)、negative control(NC組)轉染至HK-2，同時僅以LipofectamineTM2000試劑轉染細胞者設為空白對照組(Blank組)。

1.2.4RT-PCR檢測mRNA表達水平收集細胞加入RNAiso Plus (Takara)提取各組細胞總RNA。使用Nanodrop測定總RNA含量和濃度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)將mRNA逆轉錄成cDNA。應用Golden Fast PCR Kit(TIANGEN)進行PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共進行35個循環，最后72 ℃延伸10 min。引物序列如下：β-catenin(上游5’-CTTACACCCACCATCCCACT-3’，下游5’-CCTCCACAAATTGCTGCTGT-3’)、snail(上游5’-AGGATCTCCAGGCTCGAAAG-3’，下游5’-GTAGCAGCCAGGGCCTAGAG-3’)、fibronectin(上游5’-GGACATGCATTGCCTACTCG-3’，下游5’-GAATCCTGGCATTGGTCGAC-3’)、E-cadherin(上游5’-AACAGGATGGCTGAAGGTGA-3’，下游5’-CCTTCCATGACAGACCCCTT-3’)、β-actin(上游 5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’，下游 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’)。產物經過電泳后采用凝膠分析儀掃描分析。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達水平收集細胞加入RIPA 裂解液提取各組細胞總蛋白。使用Bradford Protein Assay Kit (Beyotime)測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白上樣于SDS-PAGE凝膠中，室溫下垂直電泳，0.3 A、20 V濕法電轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1.5 h，分別加入TBST稀釋的第一抗體(兔抗人β-catenin多克隆抗體，稀釋度為1∶1 000；兔抗人snail單克隆抗體，稀釋度為1∶1 000；山羊抗人fibronectin多克隆抗體，稀釋度為1∶500；兔抗人E-cadherin多克隆抗體，稀釋度為1∶800；兔抗人β-actin多克隆抗體，稀釋度為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入HRP標記的第二抗體(稀釋度1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化學發光顯影。

1.3統計學分析采用SPSS 18.0 軟件包進行統計分析。數據采用均數±標準差(mean ± SD)或中位數(IQR)表示。兩組間比較，若數據符合正態分布，采用t檢驗；若非正態分布，采用Mann-Whitney U檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析。P<0.05認為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1研究對象的臨床基線資料本研究納入經臨床和腎活檢確診為原發性IgAN患者37例(IgAN組)，因腎腫瘤行腎切除術患者16例(對照組)。兩組研究對象的臨床基線資料見表1。

表1　研究對象的臨床基線資料

2.2miR-155表達情況及臨床病理參數分析實時熒光定量PCR結果顯示，miR-155在IgAN組腎活檢組織中的表達水平明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)(見圖1A)。對入選的37例IgAN患者臨床病理參數和miR-155表達情況進行相關性分析，發現腎活檢組織中miR-155表達水平與腎小球濾過率呈負相關關系(r=-0.3368,P=0.0415)，與腎小管間質纖維化程度呈正相關關系(r=0.3764,P=0.0217)(見圖1B、1C)。

2.3miR-155對Wnt/β-catenin及下游基因表達的影響轉染48 h、72 h后收集細胞分別提取mRNA和蛋白。RT-PCR和Western blot檢測結果顯示，轉染miR-155 mimics上調HK-2細胞株內miR-155表達后，與陰性對照組或空白對照組相比，β-catenin表達明顯增加，上皮表型標志物E-cadherin表達下降，而間質表型標志物fibronectin表達上調(P<0.05，圖2、圖3)。

A：腎組織中miR-155的相對表達量(**與對照組比較，P<0.01)；B：miR-155與eGFR相關性分析；C：miR-155與腎間質纖維化相關性分析。

圖1miR-155在腎組織中表達及與臨床病理參數相關性分析

*與對照組比較，P<0.05。

*與對照組比較，P<0.05。

3　討　論

IgAN是當前我國終末期腎臟病最主要的病因之一, 其發病率有逐年上升的趨勢。IgAN的發病機制迄今尚未完全明確，可能涉及感染、遺傳、免疫和環境等多種因素。近年研究表明，腎小管間質損害尤其是腎小管間質纖維化在IgAN疾病發展過程中起著非常重要的作用。意大利學者D'Amico[4]對多項設計嚴謹的臨床研究進行薈萃分析發現，腎小球硬化和間質纖維化是IgAN病程進展及預后不良的預測因素。而Mera等[5]的研究顯示，腎小管間質損害積分對IgAN預后的預測強度高于腎小球積分。

腎小管間質纖維化是腎臟在感染、缺血、損傷以及炎癥免疫反應等多種因素刺激下，固有細胞和間質受損，炎癥介質、細胞因子釋放，導致腎小管上皮-間充質細胞轉化、肌成纖維細胞異常增殖和細胞外基質過度積聚，最終造成腎臟固有結構破壞、間質硬化。腎小管間質纖維化的形成和發展是一個動態的病理過程，涉及多種細胞因子和信號通路的異常表達調控，如TGF-β1、IGF及JAK/STAT通路、PI3K通路、Wnt/β-catenin通路等[6]。其中以Wnt/β-catenin信號通路的研究較為深入。利用單側輸尿管結扎(UUO)腎間質纖維化的動物模型，研究人員證實了Wnt、β-catenin及其下游靶基因MMP-7、FN等在慢性腎損傷過程中被誘導表達[7-9]；而采用ICG-001特異性阻斷Wnt/β-catenin/CBP信號通路可有效抑制鼠腎臟纖維化的進展[10]。我們既往的研究亦發現，β-catenin在伴有腎小管間質病變的IgAN 患者腎臟活檢組織中表達水平高于不伴腎小管間質病變的IgAN患者，提示Wnt/β-catenin通路在IgAN疾病進展過程中被激活，參與IgAN腎小管間質纖維化的形成[11]。

隨著研究的深入，miRNA在腎小管間質纖維化中的作用受到越來越多的關注，成為目前研究的熱點之一。2007年Kato等[12]率先報道了miRNA-192可以通過靶向抑制SIP1表達，在調控TGF-β1誘導糖尿病腎病腎組織內膠原的生成中發揮重要的作用。Oba S等[13]采用UUO腎間質纖維化小鼠模型研究發現，miR-200的表達呈時間依賴性上調；靜脈注射miR-200b前體可抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和纖維連接蛋白的生成，減輕腎間質纖維化程度。此外，Wang等[14]檢測發現IgAN患者尿液中miR-93表達水平高于健康對照組，且與SMAD3表達及腎小球硬化顯著相關，提示miR-93可能通過TGF-β1/SMAD3信號通路調控，參與IgAN腎臟纖維化進程。在本研究中，我們通過熒光定量PCR技術檢測發現，IgAN患者腎活檢組織中miR-155表達水平顯著高于對照組(P<0.01)，而且miR-155表達量與腎小管間質纖維化呈正相關關系(r=0.3764,P=0.0217)，這與Wang等[15]的研究結果相一致。我們利用脂質體介導miR-155模擬物瞬時轉染進行體外細胞實驗證實，上調miR-155表達可激活Wnt/β-catenin信號通路，增強間質表型標志物fibronectin表達，促進上皮間質轉化。上述研究結果提示，miR-155的表達上調與IgAN腎小管間質纖維化密切相關，其可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路參與IgAN的進展。miR-155具體的作用靶點及其調控機制還有待進一步深入研究。

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The Association of Wnt/β-catenin Signaling Pathway Regulated by miR-155 with Renal Interstitial Fibrosis in IgA Nephropathy

YEWei-biao1,LIYi1,LIUTao2,WANGZhen1,LIZhong-jun1,HUANGSu-ran1

(1.DongguanHospitalofSouthernMedicalUniversity,DongguanGuandong523059;2.GuangdongGeneralHospital,GuangzhouGuandong510080)

Objective: To investigate the expression of miR-155 in patients with immunoglobulin A nephropathy (IgAN), and to analyze its role in renal interstitial fibrosis. Methods: The expression levels of miR-155 within kidney biopsies were assessed by real-time quantitative RT-PCR. miR-155 mimics were transiently transfected into human proximal tubule epithelial cells (HK-2). The expression of epithelial and mesenchymal markers as well as transcriptional regulators in Wnt/β-catenin signaling pathway were detected by RT-PCR and Western blotting. Results: Higher miR-155 expression was found in renal biopsy tissues from IgAN patients compared to controls (P<0.01). The expression levels of miR-155 were positively correlated with renal interstitial fibrosis, but were inversely correlated with estimated glomerular filtration rate. Up-regulation of miR-155 induced the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway, which in turn increased fibronectin and reduced E-cadherin expression. Conclusion: miR-155 was elevated in IgAN patients, and the increased levels were correlated with the severity of renal interstitial fibrosis. This indicates that miR-155 may play a critical role in the pathogenesis of IgAN.

miR-155; Wnt/β-catenin; Immunoglobulin A nephropathy (IgAN); Renal interstitial fibrosis

廣東省教育廳臨床教學基地教學改革研究項目(2014JDB067)；東莞市科技計劃醫療衛生類科研一般項目(No.2015105101192、No.2014105101200)

R692.3

A

1001-5779(2016)03-0358-05

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.007

2016-02-17)(責任編輯：敖慧斌)