非小細胞肺癌組織中膜聯蛋白A2表達及其臨床意義*

杜志明，曾　娟，余俊鍵，章祖雄，謝春發，唐志賢

(贛南醫學院第一附屬醫院心胸外科，江西　贛州　341000)

?

非小細胞肺癌組織中膜聯蛋白A2表達及其臨床意義*

杜志明，曾娟，余俊鍵，章祖雄，謝春發，唐志賢

(贛南醫學院第一附屬醫院心胸外科，江西贛州341000)

目的：探討膜聯蛋白A2在非小細胞肺癌臨床診斷、治療和預后中的價值。方法：回顧分析在我院于2009年6月～2010年6月就診128例患者標本，其中正常肺組織組30例，非小細胞肺癌組98例。采用RT-PCR和免疫組化分別檢測兩組標本中膜聯蛋白A2基因水平及蛋白水平的表達，并結合肺癌患者隨訪數據運用Kaplan-Meier方法進行生存期分析。結果：膜聯蛋白A2在肺癌組織中呈高表達，并且分化程度越差、淋巴結轉移率越高及臨床分期越差ANXA2的表達越高(P<0.05)。生存分析提示ANXA2的陽性組的生存期較ANXA2陰性組的低(P<0.001)。結論：膜聯蛋白A2在非小細胞肺癌中的高表達與腫瘤的侵襲和轉移相關，能輔助判斷患者預后；并可能成為非小細胞肺癌中一個新的治療靶點。

膜聯蛋白A2；非小細胞肺癌；RT-PCR；免疫組化

肺癌目前是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，總體的治療效果和預后都不理想，其五年的生存率只有15%[1]，其發病率與死亡率已躍居我國首位。膜聯蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)是一種廣泛存在真核生物中鈣離子依賴性家族成員，并廣泛參與依賴于鈣調蛋白的活動，包括鈣離子通道的形成、調控炎癥反應、DNA修復合成、細胞分化與凋亡、細胞增殖、細胞骨架活動、成信號轉導等[2]。近來多項研究表明，ANXA2在多種腫瘤中表達失調，且其表達水平和腫瘤的發生、浸潤、轉移、病理階段密切相關[3]。目前國內研究ANXA2在肺癌患者表達與生存期關系較少。本研究通過PT-PCR及免疫組化法聯合檢測ANXA2在非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)與正常組織中的表達情況，分析其與腫瘤惡性程度、侵襲轉移能力等臨床病理因素間的關系，探討ANXA2在與NSCLC組織中的表達及其與NSCLC發生、發展及患者生存期的關系。

1　資料與方法

1.1標本及病理資料肺癌石蠟標本98例，男性58例 ,女性40例，年齡25～76歲。非腫瘤肺組織標本(慢性肺炎或肺部外傷)30例，男性12例，女性6例，年齡2l～70歲。所有標本來自贛南醫學院第一醫院2O09年6月～2010年6月門診和住院患者，所取組織分為兩部分，一部分用于PCR檢測標本均為液氮速凍，并在-80 ℃冰箱保存；另一部分用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，作5 m連續切片。所有石蠟標本均經2位病理醫師確診。在非小細胞肺癌中高分化32例，中分化23例，低分化43例。隨訪至2015年6月，共隨訪98例，另外失訪7例按截尾值處理。其中Ⅰ～Ⅱ期腫瘤患者占36.73%(36/98)；Ⅲ～Ⅳ期患者占63.27%(62/98)。

1.2半定量RT-PCR使用RT-PCR方法來檢測30例肺癌組織和30例正常肺組織中ANXA2的表達水平。用GAPDH作為內參照，采用Trizol法(北京TIANGEN生物技術公司)來提取組織中的ANXA2，PCR引物序列及擴展產物如下：ANXA2(213堿基對)的引物是5′-GATGTGAAACACTTTGCTCCT-3′(正義鏈)和5′-ATAGCGACACTTGGATAGGGG-3′(反義鏈)。GAPDH(224堿基對)的引物5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′(正義鏈)和5′-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′(反義鏈)。循環條件：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 45 s，擴增72 ℃ 60 s，循環35次；延伸72 ℃ 7 min。電泳鑒定并用凝膠成像系統(GelDot-It 300)照像，并用圖像分析軟件分析光密度值，計算相對系數。相對系數=細胞因子表達強度/GAPDH表達強度。

1.3免疫組化

1.3.1免疫組化方法采用免疫組織化學染色方法檢測98例肺癌組織中ANXA2的表達。免疫組化采用S-P法，按照試劑的說明書進行。主要步驟如下：①切片常規脫蠟至水化，PBS沖洗3次，約3 min·次-1；②抗原高溫修復；③加試劑A(過氧化物酶阻斷劑)，37 ℃，10 min；④PBS沖洗3次，每次3 min·次-1，加試劑B(非免疫動物血清)，37 ℃，10 min；⑤甩掉血清，加入50 μL的膜聯蛋白A2 一抗(濃度1∶200)，4 ℃冰箱中過夜；⑥PBS沖洗3次，3 min·次-1， 然后加試劑C(生物素標記的二抗)，37 ℃，10 min；⑦PBS沖洗3次，3 min·次-1，加試劑D(鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液)，37 ℃，10 min；⑧PBS沖洗3次，每次3 min，加新鮮配制的DAB顯色劑，顯色3～5 min；⑨自來水沖洗，蘇木素復染；⑩乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.2結果判斷ANXA2免疫組化反應的陽性物質主要定位于胞漿和胞膜，表達為棕黃色顆粒。結果判定：用雙盲法在每張切片隨機觀察5個高倍視野，每個視野計數100個瘤細胞，組織切片示胞質或胞膜染為淡黃色或棕黃色為陽性細胞標志。根據腫瘤細胞的染色程度及染色細胞百分率分析評分,著色強度分為：無色(-)為0分、淺黃色(+)為1分、黃色及更深顏色(++)為2分。著色細胞占計數細胞百分率：=50%為0分、51%～75%為1分、>75%為2分。兩項得分相乘結果=2分為陽性病例。

1.4統計學處理實驗結果應用SPSS 14.0統計軟件包，組間比較行χ2檢驗及t檢驗。根據隨訪結果行Kaplan-Meier生存分析。P<0.05認為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1ANXA2在肺癌組織與正常組織中表達情況30例肺癌組織與正常組織通過半定量RT-PCR測定ANXA2表達相對值，肺癌組織中表達相對值為：1.37±0.40，正常組織中表達相對值為：0.48±0.36。肺癌組織中ANXA2表達高于正常組織，兩者差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。

表1　ANXA2 mRNA在肺癌組織與正常肺組織中表達相對值

2.2ANXA2在肺癌組織中表達與臨床指標的關系98例非小細胞肺癌組織行免疫組化檢測并結合臨床指標進行χ2檢驗。ANXA2在NSCLC中表達與年齡、性別、組織學類型及腫瘤大小無關，差異無統計學意義(P>0.05)，而與分化程度、淋巴結轉移、臨床分期有關，差異有統計學意義(P<0.05)。分化程度越低、淋巴結有轉移及臨床分期越差ANXA2表達的陽性率就越高。見表2。

表2　ANXA2在肺癌組織中表達與臨床指標的關系

2.3ANXA2陰性及陽性患者的生存曲線在對98例ANXA2表達陽性及陰性的患者進行隨訪，并進行Kaplan-Meier生存分析，提示ANXA2陽性患者的生存期低于陰性患者，兩者差異有統計學意義(P<0.001)。見圖1。

圖1　ANXA2陰性及陽性患者的生存曲線

3　討　論

肺癌的發病率及死亡率已經躍居所有腫瘤之首，并且發病率有逐年增高趨勢。ANXA2作為在影響分子和細胞進程的多效蛋白，已經有大量的證據顯示它的異常表達，對腫瘤細胞的粘附、增殖、凋亡、侵襲和轉移以及腫瘤新血管形成造成深遠的影響[4]。腫瘤的生長過程中是腫瘤新生血管較腫瘤組織更先生長。定位于腫瘤細胞表面的ANXA2作為多種蛋白酶及細胞基質的結合位點，促進細胞外基質成分降解及腫瘤新生血管形成。本研究通過RT-PCR分析提示，在肺癌組織中ANXA2的表達水平高于正常組織(P<0.001)，這與Ohno Y[5]的研究相一致。在NSCLC免疫組化中我們發現，ANXA2的表達與年齡、性別、組織學類型、腫瘤大小均無關(P>0.05),而與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移情況及臨床分期有關，并且分化程度越差、淋巴結轉移率越高及臨床分期越差ANXA2的表達越高(P<0.05)。以上結果說明ANXA2具有促肺癌細胞增殖和侵襲的作用[6]，可能是通過ANXA2調節MMP-2和組織蛋白酶B表達起作用[7-8]。而通過靜默ANXA2的表達可以降低腫瘤的侵襲力和轉移力[9]。

在Kaplan-Meier生存分析中，ANXA2的陽性組的生存期較ANXA2陰性組的低(P<0.001)。單因素分析顯示，ANXA2的陽性與總體的生存率有關。多因素分析顯示ANXA2的表達與一些傳統的因素(腫瘤分化程度、淋巴結轉移情況及臨床分期)密切相關。這些結果都表明，ANXA2在非小細胞肺癌患者中的高表達提示該患者預后差[10]。

綜上所述，本研究結果提示ANXA2在非小細胞肺癌中的高表達與腫瘤的侵襲和轉移相關，但其在腫瘤中的發展進程中的機制尚待我們進一步去探索。相信隨著ANXA2與惡性腫瘤發展關系的深入研究，它有望被開發為用于非小細胞肺癌及其轉移的早期檢測、輔助診斷及治療的靶分子。

[1]Christofori G.New signals from the invasive front[J].Nature,2006,441(7092):444-450.

[2]Chasserot-Golaz S,Vitale N,Umbrecht-Jenck E,et al.Annexin 2 promotes the formation of lipid microdomains required for calcium-regulated exocytosis of dense-core vesicles[J].Mol Biol Cell,2005,16(3):1108-1119.[3]Pasini A,Paganelli G,Tesei A,et al.Specific Biomarkers Are Associated with Docetaxeland Gemcitabine-Resistant NSCLC Cell Lines[J].Transl Oncol,2012,5(6):461-468.

[4]Xu XH,Pan W,Kang LH,et al.Association of annexin A2 with cancer development (Review)[J].Oncol Rep,2015,33(5):2121-2128.

[5]Ohno Y,Izumi M,Kawamura T,et al.Annexin II represents metastatic potential in clear-cell renal cell carcinoma[J].Br J Cancer,2009,101(2):287-294.

[6]高昕,王述民,曲家騏,等.Annexin A2基因沉默對肺癌細胞轉移能力的影響[J].中國免疫學雜志,2012,(12):1082-1086.

[7]Wang YX,Lv H,Li ZX,et al.Effect of shRNA mediated down-regulation of Annexin A2 on biological behavior of human lung adencarcinoma cells A549[J].Pathol Oncol Res,2012,18(2):183-190.

[8]Jia JW,Li KL,Wu JX,et al.Clinical significance of annexin II expression in human non-small cell lung cancer[J].Tumour Biol,2013,34(3):1767-1771.

[9]Zhang HJ,Yao DF,Yao M,et al.Annexin A2 silencing inhibits invasion, migration,and tumorigenic potential of hepatoma cells[J].World J Gastroenterol,2013,19(24):3792-3801.

[10]Wang CY,Chen CL,Tseng YL,et al.Annexin A2 silencing induces G2 arrest of non-small cell lung cancer cells through p53-dependent and independent mechanisms[J].J Biol Chem,2012,287(39):32512-32524.

The Expression of Annexin A2 in the Tissues of Non-small-cell Lung Cancer and its Clinical Significance

DUZhi-ming,ZENGJuan,YUJun-jian,ZHANGZu-xiong,XIEChun-fa,TANGZhi-xian

(Dept.ofCardiothoracicSurgery,theFirst-affiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,GanzhouJiangxi341000)

Objective: To study the significance of Annexin A2 in the diagnosis, treatment, and prognosis of non-small cell lung cancer. Methods: One-hundred and twenty-eight clinical cases from our hospital were analyzed retrospectively from June 2009 to June 2010. They were divided into 2 groups, normal group (n=30) and non-small cell lung cancer (n=98). The gene expression and protein levels of Annexin A2 in two group specimens were measured by RT-PCR and immunohistochemistry, respectively. In addition, survival analysis was performed through Kaplan-Meier methods based on follow-up data of patients. Results: In comparison with normal group, the expression levels of Annexin A2 was significantly higher in lung cancer group; High Annexin A2 expression was positively correlated with the less degree of differentiation, higher rate of lymph node metastasis, and worse clinical stages (P<0.05). Survival analysis showed that the patients' survival time of ANXA2 positive group was significantly shorter than those of ANXA2 negative group (P<0.001). Conclusion: Annexin A2 may play an important role in the process of invasion and metastasis, and can predict the prognosis in non-small cell lung cancer, thus becoming a novel therapeutic target.

Annexin A2；Non-small-cell lung cancer；RT-PCR；Immunohistochemistry

2013年江西省贛州市指導性科技計劃項目

唐志賢，男，博士，副主任醫師，從事心胸外科專業。E-mail：tzhixian@126.com

R734.2

A

1001-5779(2016)03-0377-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.013

2016-02-25)(責任編輯：敖慧斌)