弱精子癥患者與正常生育者精漿差異蛋白的研究

李旺勝,余　蕾

(1.貴州省六盤水市人民醫院檢驗科　553401；2.貴州醫科大學附屬醫院/貴州省產前診斷中心，貴陽 553001)

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·臨床研究·

弱精子癥患者與正常生育者精漿差異蛋白的研究

李旺勝1,余蕾2

(1.貴州省六盤水市人民醫院檢驗科553401；2.貴州醫科大學附屬醫院/貴州省產前診斷中心，貴陽 553001)

目的研究弱精子癥患者精漿差異蛋白的特征。方法選取六盤水市人民醫院2015年1～12月就診的200例弱精子癥患者(研究組)，同時收集同期已婚生育健康男性200例(對照組)，采集所有研究對象的精液標本，采用Percoll技術獲得精漿，酶解獲得肽段,Shotgun技術檢測蛋白質成分。比較2組標本唯一肽段數等于1但肽段總數大于或等于4、唯一肽段數大于或等于2的結果。結果2組標本唯一肽段數等于1但肽段總數大于或等于4、唯一肽段數大于或等于2情況下，有172種差異蛋白，其中研究組89種，對照組83種。研究組89種差異蛋白有3種與運動相關蛋白、3種細胞凋亡關聯蛋白，分別為磷脂磷酸水解酶1同工型1、凝血酶敏感素1前體、相對分子質量為400×103的蛋白質，另有信號轉導蛋白10種、細胞周期蛋白4種、結構分子7種、催化活性蛋白27種、分子功能未知蛋白19種、生物進程未知蛋白29種、細胞成分未知蛋白27種。酶催化活性、信號轉導蛋白是常見差異蛋白。結論10種差異蛋白與弱精子癥緊密相關，分別為膜聯蛋白A4、蛋白S100-A9、蛋白S100-A11、維生素D結合蛋白前體、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶η前體、α輔肌動蛋白、胞質動力蛋白、相對分子質量400×103的蛋白質、白細胞介素-6受體β亞單位同工型1前體、聯蛋白Ⅵ同工型2。

弱精子癥；精漿；差異蛋白

Shotgun蛋白質檢測技術又叫鳥槍蛋白質組學策略，該技術無需蛋白純化步驟，可直接迅速鑒定蛋白混合標本中的蛋白質，消化作用將蛋白質處理成為多肽后，對多肽進行串聯質譜測序分析，利用所得多肽波譜數據對數據進行搜索，特別算法得出肽段結構特征，從而區分蛋白質[1]。為了解弱精子癥者精液蛋白差異，現對其與健康體檢者進行檢測對比。報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取六盤水市人民醫院2015年1～12月就診的200例弱精子癥患者(研究組)，年齡22～39歲，平均年齡(29.4±3.2)歲。另選同期已婚生育健康男性200例(對照組)，均經過全面檢測顯示正常，年齡23～31歲，平均年齡(30.3±2.3)歲。2組研究對象均符合入選標準：研究組精子密度大于或等于50×106/mL,a級精子(快速前向運動)比例小于25%,且a+b級精子(前向運動)小于50%,其余指標符合WHO標準。對照組精液液化時間在30 min內，精子計數大于或等于20×106/mL,a級精子大于或等于25%,或a+b級精子大于或等于50%;正常形態精子比例大于或等于15%。2組研究對象的年齡、體質量等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法2組研究對象均禁欲1周，采集精液標本。根據WHO相關標準對標本黏稠度、凝集度、精子密度、液化時間、畸形率、存活率、活動度及白細胞水平、酸性磷酸酶、果糖進行檢測。所有標本定量分裝至100微克/管，混合后使用SDS-PAGE凝膠電泳分離處理，考馬斯亮藍染色膠體標本。獲得分離圖譜后，將泳道以手術刀切割分為4段，分置于試管內，采用100 mmol/L 的NH4HCO3/30%的ACN脫色處理，清洗去除上清液后將剩余部分凍干保存；加入DTT、NH4HCO3孵化30 min，孵化溫度56 ℃，還原處理后去除上清液，各自將100 μL 100% ACN加入后等待5 min，吸除；各自加入30 μL 200 mmol/L IAA、70 μL 100 mmol/L NH4HCO3,避光靜置20 min后，去除上清液部分，再次將10 μL的 NH4HCO3(100 mmol/L)加入,室溫靜置,去除上清液，將100 μL 100% ACN加入后等待5 min，吸除，凍干；將5 μL胰蛋白酶加入標本，4 ℃保存60 min，膠塊膨脹后，根據實際體積加入緩沖液NH4HCO350 mmol/L，置37 ℃ 20 h，將酶解液吸除后移至清潔的EP管內，置入TFA、ACN，超聲粉碎后將溶液吸除，向其中加入前次溶液，如此抽提重復3次，合并且凍干。毛細血管反相色譜、電噴霧線性離子阱質譜分析標本，并通過碎片圖譜掃描、全掃描技術分析多肽及多肽碎片質量電荷比。結合分析結果對蛋白質庫進行搜索，SEQUEST方法整合分析結果，從而獲得蛋白質鑒定結果，并使用GOA軟件對蛋白質進行分類鑒定。

1.3統計學處理采用SPSS20.0統計軟件對數據進行分析，計數資料對比應用χ2檢驗，計量資料比較使用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.12組研究對象精漿差異蛋白檢測結果比較2組研究對象標本唯一肽段數等于1但肽段總數大于或等于4、唯一肽段數大于或等于2時，有172種差異蛋白，其中研究組標本有89種，對照組標本有83種。見圖1～3。

圖1　　精漿SDS PAGE譜圖及切膠部位

圖2　　對照組精漿蛋白MS-MS圖

2.22組研究對象差異蛋白的功能分類2組標本差異蛋白采用GOA軟件分類處理，表明研究組89種差異蛋白有3種運動相關蛋白、3種細胞凋亡關聯蛋白，分別為磷脂磷酸水解酶1同工型1、凝血酶敏感素1前體、相對分子質量為400×103的蛋白質，另有信號轉導蛋白10種、細胞周期蛋白4種、結構分子7種、催化活性蛋白27種、分子功能未知蛋白19種、生物進程未知蛋白29種、細胞成分未知蛋白27種。酶催化活性、信號轉導蛋白是常見差異蛋白。

圖3　　研究組精漿蛋白MS-MS圖

3　討　　論

臨床研究者一致認可的蛋白質研究常見工具是Shotgun蛋白質組學策略，該方式主要借助LC-MS/MS串聯質譜偶聯液相層析技術完成混合物中蛋白質的鑒別，省去蛋白質純化的時間和步驟[2-3]。鑒定到的蛋白質根據peptide counts和unique peptide counts這2個參數將其可信度分級:peptide是鑒定到的肽段總數(這里指重復肽段也被包含在內),非重復肽段即unique peptide counts是指某組、某種蛋白質特有的唯一肽段數，其中可信度最高的蛋白質為unique peptide counts大于或等于2類，其次為unique peptide counts等于1，再次為peptide counts大于或等于4類[4-5]。

人體精漿的蛋白有較大差別，本研究結合以往成功案例，對2組研究對象均使用混合同類標本進行鑒定，以保證整體研究的順利進行和最終結果的可信度，同時增加對比研究，以提高標本例數縮小個體差異[6-7]。

本研究探討弱精子癥者精液蛋白差異，對研究組200例和對照組200例的精液標本蛋白進行檢測比較，采用Percoll技術分離得到精漿、酶解獲得肽段、Shotgun技術測定蛋白質成分，對比2組標本唯一肽段數等于1但肽段總數大于或等于4、唯一肽段數大于或等于2的結果[8-9]。 本研究結果顯示，2組標本唯一肽段數等于1但肽段總數大于或等于4、唯一肽段數大于或等于2時，有172種差異蛋白，其中研究組89種，對照組83種。研究組89種差異蛋白有3種與運動相關的蛋白、3種細胞凋亡關聯蛋白，分別為磷脂磷酸水解酶1同工型1、凝血酶敏感素1前體、相對分子質量為400×103的蛋白質，另有信號轉導蛋白10種、細胞周期蛋白4種、結構分子7種、催化活性蛋白27種、分子功能未知蛋白19種、生物進程未知蛋白29種、細胞成分未知蛋白27種。酶催化活性、信號轉導蛋白是常見差異蛋白。10種差異蛋白與弱精子癥緊密相關，分別為膜聯蛋白A4、蛋白S100-A9、蛋白S100-A11、維生素D結合蛋白前體、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶η前體、α輔肌動蛋白、胞質動力蛋白、相對分子質量400×103的蛋白質、白細胞介素-6受體β亞單位同工型1前體、聯蛋白Ⅵ同工型2。

Shotgun鑒定方式也存在一定的局限性,該技術無法發現在表達豐度上有顯著差異的蛋白質，提示本研究得到的172種差異性的蛋白質均為“有和無”的關系,這些蛋白質不能完全代表正常生育者精漿和弱精子癥精漿蛋白質的差異性。進一步的功能鑒別分類則精細化地區別與病情有直接關聯的差異性蛋白質[10]。

綜上所述，弱精子癥患者精液差異蛋白應著重與研究所示的172種差異蛋白進行鑒別和統計分析，篩選關聯密切和重要度高的蛋白質，通過添加蛋白和封閉方式獲取功能、去除功能，觀察精子運動能力變化情況，精準尋找差異蛋白，為臨床診療工作取得突破性的進展。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.044

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1673-4130(2016)19-2759-03

2016-04-21

2016-06-19)