羊膜提取液治療兔干眼癥的實驗研究

杜　娟，李志輝，趙奮圖，邵　毅，姜　楠，湯學付，馮敏婷

?

·實驗論著·

羊膜提取液治療兔干眼癥的實驗研究

杜娟1,2，李志輝1，趙奮圖1，邵毅2，姜楠2，湯學付1，馮敏婷1

?METHODS: Totally 26 rabbits (26 right eyes) with dry eye model were studied and divided into two groups: group A (control group with PBS eye drops,n=13) and group B (amniotic extraction group,n=13). Another two rabbits were chosen as normal control．The Schirmer Ⅰ tests (SⅠt) and corneal fluorescein staining (FL) were made, and the tear total protein content, amylase activity, lactoferrin, lysozyme contents, goblet cell density were performed in two groups before treatment and 1, 2, 4 and 8 wk after treatment.

?RESULTS: There were significant differences in SIT, FL scores, lysozyme activity and goblet cell density among different groups at different time points (P<0.05). But, there was no significant differences in SⅠt, FL scores, lysozyme activity and goblet cell density between two groups before treatment (P>0.05). After 8wks’ treatment with PBS, the mean differences of the group A showed great changes in SⅠt, lysozyme and goblet cell density compared with those before treatment (P<0.05); but there was no significant differences in FL scores compared with those before treatment (P>0.05). As for group B, 8wks after treatment, there were statistical changes in SⅠt, FL, lysozyme (P<0.05); but there was no significant differences in goblet cell density compared with those before treatment (P>0.05). It was evident that statistical differences were observed in SⅠt, FL scores, lysozyme activity and goblet cell density between two groups at each time point (P<0.05). However, there were no significant differences in total protein, lactoferrin, amylase activity at different time points (P>0.05). Meanwhile there was no significant differences in total protein, lactoferrin, amylase activity between two groups before treatment (P>0.05). But there were significant differences in total protein, lactoferrin, amylase activity between two groups after 4 and 8 wks’ treatment (P<0.05).

?CONCLUSION: Amniotic extraction has significant therapeutic effect on the dry eye in rabbit model.

目的:研究羊膜提取液對苯扎氯銨誘導的兔干眼的治療作用。

方法:選擇新西蘭大白兔26只(26眼，均為右眼)，使用0.2%的苯扎氯銨制作兔干眼癥模型，隨機分為兩組：對照組(A組，13眼)使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)滴眼，實驗組(B組，13眼)使用1%羊膜提取液(amniotic extraction)滴眼，4次/d。另選取2只兔作為正常對照。分別于治療前和治療1、2、4、8wk行Schirmer I試驗(Schirmer Ⅰ test，SⅠt)、角膜熒光素染色(corneal fluorescein staining，FL)、淚液總蛋白含量、淀粉酶活性、乳鐵蛋白、溶菌酶含量檢測，并進行結膜印跡細胞檢查。

結果:不同組間、不同時間點間SⅠt、FL、溶菌酶活性及結膜杯狀細胞密度相比，差異有統計學意義(P<0.05)。治療前兩組SⅠt、FL、溶菌酶活性及結膜杯狀細胞密度相比，差異無統計學意義(P>0.05)；治療1、2、4、8wk后，B組SⅠt、FL、溶菌酶活性較治療前均有不同程度改善，差異有統計學意義(P<0.05)，B組結膜杯狀細胞密度與治療前相比有所增加，但差異無統計學意義(P>0.05)；治療1、2、4、8wk后，A組SⅠt、溶菌酶活性及結膜杯狀細胞密度均有不同程度下降，差異有統計學意義(P<0.05)，A組FL評分與治療前相比有不同程度增加，但差異均無統計學意義(P>0.05)。A、B兩組各時間點SⅠt、FL、溶菌酶活性及結膜杯狀細胞密度相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。同一組內不同時間點，淚液中總蛋白量、乳鐵蛋白、淀粉酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。治療前A、B兩組淚液中總蛋白量、乳鐵蛋白、淀粉酶的活性相比，差異無統計學意義(P>0.05)；治療4、8wk后兩組淚液中總蛋白量、乳鐵蛋白、淀粉酶的活性相比，其差異有統計學意義(P<0.05)。

結論:羊膜提取液能有效治療兔干眼癥，具有良好的臨床應用前景。

羊膜提取液；干眼；治療；淚液蛋白

引用：杜娟，李志輝，趙奮圖，等.羊膜提取液治療兔干眼癥的實驗研究.國際眼科雜志2016;16(7):1232-1236

0引言

干眼癥是由不同的原因引起淚液質或量的異常，或因淚液動力學異常而導致的淚膜穩定性下降和(或)眼表面損害的一大類疾病的總稱，患病率達5%～34%[1]。輕度干眼可引起眼部刺激癥狀，如眼部干澀、燒灼、疼痛、易疲勞等，若無規范治療，將會導致角膜上皮持續損害、角膜新生血管形成以及眼表鱗狀上皮化生等眼表異常，導致視力障礙，甚至致盲[2]。目前國內治療干眼癥主要是通過人工淚液點眼來緩解干眼癥狀，只對輕度干眼取得較好效果，對中重度干眼效果不好。手術行離體頜下腺移植對部分嚴重的干眼有一定的治療效果，但其應用受適應證限制，且創傷大，推廣有很大的難度，遠期療效有待觀察。淚液保留治療、性激素治療、中醫治療往往受療效、副作用和(或)患者依從性等因素限制，通常只作為干眼的輔助治療措施，因此尋找新型的手段來治療中重度干眼癥是十分必要的。羊膜具有促進角膜上皮愈合、抗炎、抗瘢痕形成和抑制新生血管形成等諸多生物學活性，但是目前應用羊膜需行羊膜移植手術，不僅僅增加了患者的費用及潛在風險，更重要的是，羊膜覆蓋在角膜表面必將對患者早期的視功能造成明顯的影響，這極大地降低了患者的生活質量。我們提取羊膜中的有效成分制成眼液[3]，探討羊膜提取液在治療干眼損傷中的應用效果，為以后提高干眼的臨床治愈率提供實驗依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1羊膜提取液的制備取排除傳染性疾病的剖腹產胎盤，清洗后將羊膜分離，液氮冷凍，研磨，加入醫用生理鹽水，勻漿，勻漿液置于0℃～4℃保存5d，加熱過濾后調節濾液pH值到3，靜置過濾，再將濾液pH值調節至7.2，在無菌條件下使用0.20～0.22μm濾膜過濾，取濾液，0℃～4℃保存備用。本研究所涉及的全部研究方法均遵循《赫爾辛基宣言》，符合醫學倫理學原則，并獲得南方醫科大學附屬順德第一人民醫院及南昌大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.1.2實驗動物取新西蘭大白兔26只(均為2月齡，雌性，體質量2～2.5kg)，由南昌大學動物實驗室提供。使用裂隙燈顯微鏡及眼底鏡檢查眼前節、眼底無異常，Schirmer Ⅰ試驗(Schirmer I test，SⅠt)≥10mm/5min。

1.2方法

1.2.1干眼動物模型的建立依據之前的實驗方法制作干眼動物模型[4]：26只實驗動物均使用0.1%苯扎氯銨溶液滴眼，2次/d，持續使用2wk。造模完成后將實驗動物隨機分為2組(每組13只，均為右眼)：磷酸鹽緩沖液對照組(A組)、羊膜提取液組(B組)，分別使用磷酸鹽緩沖液和羊膜提取液連續滴眼2mo，4次/d。于滴眼治療前和治療1、2、4、8wk分別對兩組兔行SⅠt檢查、角膜熒光素染色(corneal fluorescein staining，FL)、淚液蛋白測定、結膜印跡細胞學檢查。

1.2.2 SⅠt檢測取5mm×35mm有刻度的試紙，一端反折5mm后放置于下方結膜囊中外1/3處，靜待5min后取出濾紙，記錄該紙帶的潤濕長度(mm)。參照文獻的標準[5]，以≥10mm/5min為正常。進行每次檢查時應注意控制變量，應由同一人在相同的時間、地點、相同的照明亮度、濕度及溫度下操作。

1.2.3角膜熒光素染色使用1滴1%熒光素鈉滴眼，使其瞬目，參考國家眼科研究臨床干眼評分系統[6]將其分為0～3級：無染色(0級)；少量的播散性污漬染色(1級)；中度污漬染色(2級)；重度融合性污漬染色(3級)。

1.2.4淚液蛋白測定用毛細吸管于兔下淚河吸取非刺激性淚液(約20μL)，置于-80℃冰箱中保存，將小牛血清白蛋白做為標準，Brandford法測定淚液總蛋白含量。4，6-亞乙基-對硝基苯-α-D-麥芽七糖苷(EPS-PNP-G7)測量其淀粉酶活性(Leadman Group Co.Ltd，北京)[7]。雙色讀數在405nm和546nm采用自動生化分析儀分析(LX20；Beckman，Fullerton，CA)；使用放射免疫分析法測定乳鐵蛋白含量[8]：取淚液樣品10μL，用生理鹽水進行1∶100稀釋，制作出標準曲線后計算出乳鐵蛋白含量。使用試管比濁法測定溶菌酶含量，溶菌酶測試盒、染色菌液的制備、溶菌酶標準液的配置及標準曲線的繪制均按說明書進行；將淚液與染色菌液混勻后離心取上清液，根據測定管與樣品對照管光密度差值，可查標準曲線后得出樣品中溶菌酶含量。為控制變量,每次檢查應由同一人在上午9∶00～11∶00完成。

1.2.5結膜印跡細胞檢查參照Cordelia等[9]的方法：檢查前應用1%愛爾卡因表面麻醉，5min后用濾紙吸去結膜囊淚液，將醋酸纖維膜剪出3mm×3mm大小,并將其粗糙面貼于距上方角膜緣2mm的球結膜表面，輕輕加壓，3～5s后撕下，于其左右相鄰的區域再各貼一張，將其固定在95%酒精中30min，蘇木精和碘酸-希夫(PAS)試劑染色，在雙目光學顯微鏡高倍視野下對結膜杯狀細胞計數。

表1　兩組治療前后各時段淚液分泌情況比較，mm/5min)

注：A組：對照組；B組：羊膜提取液組；aP<0.05vs治療前；cP<0.05vsA組。

表2　兩組治療前后各時段FL評分情況比較±s，分)

注：A組：對照組；B組：羊膜提取液組；aP<0.05vs治療前；cP<0.05vsA組。

表3　兩組治療前后淚液蛋白情況比較±s

注：A組：對照組；B組：羊膜提取液組；aP<0.05vs治療前；cP<0.05vsA組。

2結果

2.1治療前后及兩組間SⅠt檢測指標結果比較不同組間、不同時間點間SⅠt相比，差異有統計學意義(F=6.20、12.23，P<0.05)。治療前A、B兩組SⅠt相比，差異無統計學意義(t=0.04，P>0.05)。治療1、2、4wk，B組的SⅠt均較治療前有不同程度的增加，但差異無統計學意義(P>0.05)；治療8wk，與治療前相比差異具有統計學意義(P<0.05)。治療1、2wk，A組的SⅠt均較治療前有不同程度的降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；治療4、8wk，與治療前相比差異具有統計學意義(P<0.05)。各時間點A、B兩組SⅠt相比，治療4、8wk時差異具有統計學意義(t=3.41、5.56，P<0.05，表1)。

2.2治療前后及兩組間FL評分結果比較不同組間、不同時間點間FL相比，差異有統計學意義(F=12.01、5.72，P<0.05)。治療前A、B兩組的FL評分相比，其差異無統計學意義(t=0.06，P>0.05)。治療1、2wk后，B組FL評分較治療前有不同程度的降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；治療4、8wk后，與治療前相比其差異具有統計學意義(P<0.05)。A組FL評分與治療前相比有不同程度增加，但差異均無統計學意義(P>0.05)。A、B兩組的FL評分在治療后2、4、8wk比較,其差異均有統計學意義(t=3.09、4.87、5.58，P<0.05，表2)。

2.3兩組用藥前后各時間點淚液蛋白比較不同組間、不同時間點間溶菌酶活性相比，差異有統計學意義(F=31.59、14.97，P<0.05)。治療前A、B兩組淚液中溶菌酶活性相比，差異無統計學意義(t=0.20，P>0.05)；在治療2、4、8wk后，B組淚液中溶菌酶活性與治療前相比有不同程度增加，其差異有統計學意義(P<0.05 )；而治療1、2、4、8wk后，A組淚液中總溶菌酶活性與治療前相比有不同程度下降，其差異有統計學意義(P<0.05 )；在治療2、4、8wk后A、B兩組溶菌酶活性相比，其差異有統計學意義(t=7.13、8.19、10.83，P<0.05)。不同時間點，淚液中總蛋白量、乳鐵蛋白、淀粉酶活性差異無統計學意義(F=0.10、0.70、0.40，P>0.05)。治療前A、B兩組淚液中總蛋白量、乳鐵蛋白、淀粉酶的活性相比，差異無統計學意義(t=0.05、0.20、0.21，P>0.05)；治療4、8wk后兩組淚液中總蛋白量、乳鐵蛋白、淀粉酶的活性相比，B組活性增加，A組降低，其差異有統計學意義(t=5.25、8.52、4.56，P<0.05，表3)。

2.4兩組不同時間點結膜杯狀細胞密度比較不同組間、不同時間點間結膜杯狀細胞密度相比，差異有統計學意義(F=30.03、82.87，P<0.05)。治療前A、B兩組結膜杯狀細胞密度，其差異無統計學意義(t=0.18，P>0.05)。在治療1、2、4、8wk后，B組結膜杯狀細胞密度與治療前相比有所增加，但差異無統計學意義(P>0.05)。在治療2、4、8wk后，A組結膜杯狀細胞的密度下降，與治療前相比其差異均有統計學意義(P<0.05)。A、B兩組的結膜杯狀細胞密度在治療2、4、8wk后相比，差異均有統計學意義(t=6.61、10.14、12.50，P<0.05，表4，圖1)。

圖1兩組不同時間點結膜杯狀細胞密度檢查結果(×400)A：對照組治療前；B：對照組治療1wk；C：對照組2wk；D：對照組4wk；E：對照組8wk；F：羊膜提取液組治療前；G：羊膜提取液組治療1wk；H：羊膜提取液組2wk；I：羊膜提取液組4wk；J：羊膜提取液組8wk。

表4　兩組治療前后各時段杯狀細胞密度情況比較±s，個/高倍視野)

注：A組：對照組；B組：羊膜提取液組；aP<0.05vs治療前；cP<0.05vsA組。

3討論

我國干眼癥的發病率逐漸升高并有年輕化趨勢，大量的研究已經證實，中重度干眼除了因淚液缺乏和(或)異常引起的眼部不適之外，常常存在不同程度的眼表炎癥。研究表明，中重度干眼眼表上皮細胞及淚液中IL-1、γ-INF、NF-κB等炎性相關因子含量增加，加用抗炎藥物對中重度干眼治療有效[10-11]。引起干眼患者眼表炎癥發生的原因復雜多樣，可能與眼表摩擦增加、淚液滲透壓增加、淚液分泌反射弧的反饋機制等因素有關。其次，由于眼表上皮與淚膜密切相關，互相依賴和影響。長期的淚液缺乏和(或)異常，還可導致眼表上皮微絨毛減少及缺乏，甚至發生鱗狀上皮化生。在眼表疾病中，干眼是引起角膜和結膜鱗狀上皮化生常見的原因。通過體外實驗推測與證實，干眼患者長期的淚液缺乏，眼表上皮暴露于空氣中，可以誘導眼表上皮角蛋白K10、Ki67、K14、K16和P63等陽性表達和上調，引起眼表上皮異常分化和增殖，導致眼表上皮鱗狀上皮化生[12-13]。此外，中重度干眼長期的眼表慢性炎癥也是引起眼表上皮鱗狀上皮化生重要的原因[14]。鱗狀上皮化生不僅影響了眼表上皮對淚液的黏附功能，更因為眼表上皮細胞成分的改變(如杯狀細胞及副淚腺的減少與缺乏)嚴重影響了淚液的正常分泌，導致干眼進一步加重，形成惡性循環。

羊膜是從細胞滋養層衍化而來，位于胎膜的最內層，它包括五層：上皮層、基底膜、致密層、纖維母細胞層及海綿層，用于眼科的羊膜去除了纖維母細胞層及海綿層。1995年Kim等[15]重新將羊膜引入眼科領域，用不含絨毛膜的保存羊膜進行移植，使兔化學燒傷模型的角膜表面獲得上皮化。此后，羊膜在眼科的應用逐漸開展。由于羊膜包含了大量的生物活性成分(如bFGF、EGF、HGF、KGF等多種生長因子及神經生長因子和P物質等)，對角膜神經有營養作用，具有促進角膜上皮愈合、抗瘢痕形成、抗炎和抑制新生血管形成等諸多生物學活性，因此羊膜移植已成為當今眼表手術的一個熱點，被廣泛應用于眼表疾病的預防和治療。然而羊膜移植術作為一種手術，不僅加重了患者的心理負擔，而且在羊膜溶解前明顯影響了患者的視覺質量，因此限制了其在干眼方面的應用。如果能夠提取羊膜中的有效成分制成滴眼液，則可克服羊膜移植手術帶來的缺陷。近年來，一些學者致力于這方面的研究，越來越多的研究證明：從羊膜中提取其中的可溶性成分制成羊膜提取液，同樣具有抗炎、抗瘢痕形成和抑制新生血管形成等生物學活性。He等[16]研究表明，羊膜提取液可以抑制體外培養的RAW264.7細胞的凋亡，Jiang等[3]的體內體外實驗均證實羊膜提取液具有抑制新生血管生長的作用。本課題組改進了羊膜提取液的提取方法，將其應用于準分子激光角膜切削術(photorefractive keratectomy，PRK)后的兔眼，發現其可以減輕PRK術后haze的發生。又有研究發現[17]在一組化學傷的患者中使用羊膜提取液，其可以有效減輕眼表局部炎癥反應、抑制新生血管形成及促進角膜上皮的修復。最近的體外實驗還證明[18]羊膜提取液能有效抑制結膜鱗狀上皮化生，其機制可能與其抑制Wnt信號通路的活化相關。實驗表明，羊膜提取液在用藥2mo后可明顯改善兔干眼SⅠt、FL評分、淚液蛋白成分及結膜杯狀細胞密度，PBS治療則改善不明顯，可能的原因是羊膜提取液主要通過減輕眼表局部炎癥反應、抑制結膜鱗狀上皮化生從而維持了淚液的分泌水平，延緩了干眼癥的發生。

綜上所述，滴用羊膜提取液可較快而明顯地改善干眼的癥狀和維持淚液蛋白成分。它是一種安全有效、給藥途徑簡單、副反應少且廉價的治療干眼的方法，具有廣泛臨床應用及推廣價值，進一步將探討其作用的受體、信號轉導途徑、調節機制和有關在臨床方面的應用。

1 Lemp MA. The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Work Shop.OculSurf2007；5(2):75-92

2 Messmer EM. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.DtschArzteblInt2015；112(5):71-81

3 Jiang A,Li C,Gao Y,etal.Invivoandinvitroinhibitory effect of amniotic extraction on neovascularization.Cornea2006；25(10):S36-40

4 Xiong C,Chen D,Liu J,etal. A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride.InvestOphthalmolVisSci2008;49(5):1850-1856

5中華醫學會眼科學分會角膜病學組.干眼臨床診療專家共識.中華眼科雜志 2013；49(1):73-75

6 Lemp MA. Report of the National Eye Institute/Industry Workshop on Clinical Trials in Dry Eyes.CLAOJ1995；21(4):221-232

7 Chen ZY, Jie Y, Yu GY. Treatment of severe keratoconjunctivitis sicca by parotid duct transposition after tympanic neurectomy in rabbits.InvestOphthalmolVisSci2011；52(9):6964-6970

8邵毅，余瑤，王樂，等.真性糖尿病白內障患者超聲乳化術后角膜神經和淚液蛋白的特點.中國糖尿病雜志 2014；22(3):216-219

9 Chan CM, Liu YP, Tan DT. Ocular surface changes in pterygium.Cornea2002；21(1):38-42

10 Chang He, Peilong Lai, Jianyu Weng,etal. Toll- like receptor 2-mediated NF-κB inflammatory responses in dry eye associated with cGVHD.MolVis2011；17(8):2605-2611

11 Zhu L, Zhang C, Chuck RS. Topical steroid and non-steroidal anti-inflammatory drugs inhibit inflammatory cytokine expression on the ocular surface in the botulium toxin B-induced murine dry eye model.MolVis2012；18(6):1803-1812

12 Li W, Hayashida Y, Chen YT,etal. Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium.InvestOphthalmolVisSci2008；49(1):154-162

13 Tan Y, Qiu FF, Qu YL,etal. Amniotic membrane inhibits squamous metaplasia of human conjunctival epithelium.AmJPhysiolCellPhysiol2011；301(1):C115-125

14 Chen YT, Nikulina K, Lazarev S,etal. Interleukin-1 as a Phenotypic Immunomodulator in Keratinizing Squamous Metaplasia of the Ocular Surface in Sj?gren’s Syndrome.AmJPathol2010;177(3):1333-1343

15 Kim JC, Tseng SC. Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbitcorneas.Cornea1995；14 (5):473-484

16 He H, Li W, Chen SY,etal. Suppression of activation and induction of apoptosis in RAW264.7 cells by amniotic membrane extract.InvestOphthalmolVisSci2008；49(10):4468-4475

17 Liang LY, Li W, Ling SQ,etal. Amniotic membrane extraction solution for ocular chemical burns.ClinExpOphthalmol2009；37(3):855-863

18 Lin ZR, Liu XC, Zhou T,etal. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride.MolVis2011；17(1):257-264

Therapeutic efficiency of amniotic extraction for dry eye rabbit model

Juan Du1,2, Zhi-Hui Li1, Fen-Tu Zhao1，Yi Shao2, Nan Jiang2, Xue-Fu Tang1, Min-Ting Feng1

s:National Natural Science Foundation of China (No.81160118, 81400372); Medical Scientific Research Foundation of Foshan Municipal Health Bureau (No.2015306)

Yi Shao. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China. freebee99@163.com

2016-02-29Accepted：2016-06-15

?AIM: To investigate therapeutic efficiency of amniotic extraction on dry eye in rabbit model induced by topical benzalkonium chloride (BAC).

amniotic extraction; dry eye; treatment; tear protein

國家自然科學基金資助項目(No.81160118，81400372)；佛山市衛生和計生局醫學科研項目(No.2015306)

1(528300)中國廣東省佛山市，南方醫科大學附屬順德第一人民醫院眼科；2(330006)中國江西省南昌市，南昌大學第一附屬醫院眼科

杜娟，畢業于南華大學醫學院，碩士，主治醫師，研究方向：角膜病、眼表疾病。

邵毅，畢業于中山大學中山眼科中心，副主任醫師，副教授，研究方向：角膜病、眼表疾病.freebee99@163.com

2016-02-29

2016-06-15

Du J, Li ZH, Zhao FT,etal. Therapeutic efficiency of amniotic extraction for dry eye rabbit model.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(7):1232-1236

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.7.07

1Department of Ophthalmology, the First People’s Hospital of Shunde, Foshan 528300, Guangdong Province, China;2Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China