豬繁殖與呼吸綜合征病毒微載體培養(yǎng)試驗研究

劉曉航 夏一今/哈藥集團生物疫苗有限公司李一經(jīng)/東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院

豬繁殖與呼吸綜合征病毒微載體培養(yǎng)試驗研究

劉曉航 夏一今/哈藥集團生物疫苗有限公司
李一經(jīng)/東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種以感染豬發(fā)熱、厭食，妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃伊胎，各種年齡豬（特別是仔豬）呼吸障礙為特征的高度傳染性疾病。郭寶清等（1996）首次從國內(nèi)疑似PRRS感染豬群中分離出PRRSV，從而證實了本病在我國的存在。此病常為地方流行性，長期危害養(yǎng)豬生產(chǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

目前，豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的生產(chǎn)主要是轉瓶細胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，進而增殖PRRSV。但轉瓶培養(yǎng)細胞增殖較為緩慢而且生產(chǎn)過程中對細胞和病毒的培養(yǎng)條件，如pH、溶氧、糖耗等難以監(jiān)控和適時補給，無法提供最佳的培養(yǎng)條件，造成該方法自動化程度低，勞動強度大，并因為轉瓶細胞培養(yǎng)環(huán)境的不可控性，導致存在生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性不夠、批間差較大、產(chǎn)量低等問題。

本研究摸索了利用微載體大規(guī)模培養(yǎng)Marc-145細胞增殖PRRSV病毒的條件，根據(jù)試驗結果確定最佳增殖條件，為以哺乳動物細胞為基質(zhì)大規(guī)模增殖病毒及制備藍耳病疫苗提供依據(jù)。

一、材料與方法

1.毒株與細胞。PRRSV Hun4 F112株病毒由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬病分子診斷實驗室惠贈；Marc-145細胞由本單位保存，傳代培養(yǎng)至54代。

2.主要設備與試劑。5 L生物反應器（B5，Sartorius，Germany）；Cytodex-1購自GE Healthcare公司；DMEM購自Life technology；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

3.靜置培養(yǎng)。Marc-145細胞生長至3 d～4 d后，細胞基本鋪滿方瓶時，先用PBS清洗2次，再加入0.25%胰酶（含0.02% EDTA）溶液消化，傾去胰酶，加含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打，T75方瓶以1∶3～1∶4的比率傳代。

4.微載體培養(yǎng)。

（1）微載體處理。用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液清洗并浸泡至少3 h后，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌25 min，冷卻后儲于4℃密封待用。使用前用37℃的細胞培養(yǎng)液清洗2遍。

（2）Marc-145細胞的反應器培養(yǎng)優(yōu)化。

①不同初始密度細胞對細胞生長的影響。不同初始密度1.5×105個細胞/ml、3.0×105個細胞/ml、4.5×105個細胞/ml的Marc-145細胞分別接種于5 L反應器中，微載體用量為3 g/L，觀察不同初始密度對細胞生長的影響，確定最佳接種細胞密度。

②攪拌速度對細胞生長的影響。本實驗分別考察了攪拌速度為50/min、75 r/min和100 r/min時Marc-145細胞在DMEM培養(yǎng)基中的生長情況，微載體濃度為3 g/L。以3.0×105cells/ml細胞密度接種于5 L反應器中，工作體積為2 L，每隔8 h進行監(jiān)測，取樣計數(shù)細胞。

③不同微載體濃度對細胞生長的影響。微載體供應商GE公司推薦的微載體濃度為2～3 g/L，分批培養(yǎng)細胞時一般不超過5 g/L。本實驗考察了微載體濃度為1 g/L、3 g/L和5 g/L時細胞的生長情況。

④代謝產(chǎn)物對細胞生長的影響。Marc-145細胞培養(yǎng)過程中，乳酸和葡萄糖的代謝情況是細胞生長的主要指標。因此，本研究檢測細胞生長過程中葡萄糖、乳酸代謝情況，并對灌注策略進行分析。

5.微載體培養(yǎng)PRRSV病毒條件優(yōu)化。

（1）病毒感染量（MOI）的確定。細胞培養(yǎng)48 h后，分別以MOI=0.01、0.1、0.5、1和5接種病毒，檢測病毒滴度。

（2）病毒感染時間（TOI）的確定。細胞分別培養(yǎng)24、48、72和96 h后，以1.3.1中優(yōu)化的MOI接種病毒，檢測病毒滴度。

（3）病毒測定。樣品TCID50測定：將在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的Marc-145細胞消化，稀釋至所需的細胞密度（0.8～1.0×105cells/ml，即每孔8 000～10 000個細胞），向96孔板中每孔加100μl細胞懸液；置培養(yǎng)箱中37℃孵育24 h至細胞鋪成單層約60%豐度；取出孔板，吸去培養(yǎng)液，每孔添加約100μl PBS搖晃洗滌2遍以除去血清；將10倍比系列稀釋好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，從1到11作11個梯度，從A到H作8個重復，最后一列（A12-H12）做陰性對照（各加100μl病毒稀釋液），置培養(yǎng)箱37℃孵育1 h；吸除病毒液，加入100μl細胞維持液；置培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變和對照，共觀察2～5日，并記錄細胞病變的孔數(shù)，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50。同時以相同的方法對用轉瓶培養(yǎng)的PRRS病毒液進行TCID50測定。以此作為對照組。

6.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫原性實驗。免疫攻毒測定：用5～6周齡健康易感仔豬15頭，隨機分為3組，每組5頭。一組用供試疫苗進行免疫保護，另一組用轉瓶苗進行保護；兩組試驗豬各頸部肌肉注射疫苗1頭份。第三組不接種疫苗，作為對照，在相同條件下隔離飼養(yǎng)。28日后，所有豬各肌肉注射檢驗用強毒HuN4株的病毒培養(yǎng)液（104.0TCID50/ml）1 ml，每頭滴鼻2 ml，每日測溫并觀察21日。

二、結果

1.初始細胞密度的確定。當微載體用量為3 g/L時，初始細胞密度1.5×105個細胞/ml、3.0×105個細胞/ml和4.5×105個細胞/ml使得Marc-145細胞在微載體上生長曲線有所差異（圖1）。低初始密度 （1.5×105個細胞/ml）使Marc-145細胞的延遲期延長，這是由于單個微載體上分布的細胞過少，同時微載體的空球率較高 （圖2A），細胞生長缺乏初始密度效應而造成生長相對緩慢，最大細胞密度也最低，但細胞存活率始終維持在較高水平。4.5×105個細胞/ml的初始密度可以使Marc-145細胞快速進入生長期，但細胞存活率相對較低，這是由于接種后細胞存在聚團和游離細胞不黏附的現(xiàn)象，雖然單個微載體上分配的細胞個數(shù)很多，但不能提供有效的黏附生長表面，不利于細胞生長（圖2C）。所以細胞接種于微載體上培養(yǎng)時，合適的細胞初始密度（3×105個細胞/ml）既能均勻分布細胞于每個微載體表面，促使細胞快速生長，同時也為細胞的生長預留了充裕的生長表面，最終獲得較好的培養(yǎng)效果，維持較高的細胞存活率（圖2B）。細胞不同密度接種對細胞的增殖會有較明顯的影響，初始密度過小和過大均不利于細胞的增殖，中密度接種較為適合。

圖1　不同初始密度的Marc-145細胞在3g/L微載體上生長曲線

圖2　不同初始密度的Marc-145細胞在3g/L微載體上培養(yǎng)6 h時的黏附效率比較

2.攪拌速度對細胞生長的影響。微載體培養(yǎng)過程中為了使微載體充分懸浮，必須要有足夠高的攪拌速度；但過度的攪拌會延長細胞貼壁時間，嚴重損傷已貼壁細胞，尤其對有絲分裂周期細胞的傷害更大，導致細胞密度降低。因此本實驗分別考察了攪拌速度為80/min、100 r/min和120 r/min時Marc-145細胞在DMEM培養(yǎng)基中的生長情況。結果如圖3所示，當攪拌速度為80 r/min時，細胞密度緩慢上升，最高細胞密度僅為8.3×105cell/ml，這可能是因為攪拌速度過低，轉瓶中氧傳質(zhì)速度不能滿足細胞消耗，因此細胞生長不出現(xiàn)對數(shù)生長期；攪拌速度為120 r/min時，最高密度大于前者，但也明顯小于當攪拌速度為100 r/min時的最高細胞密度，說明這時攪拌過度，對細胞產(chǎn)生了嚴重的剪切傷害。攪拌速度為100 r/min時，細胞快速進入對數(shù)生長期，56 h時細胞最高密度為1.8×106cell/ml，因此我們確定100 r/min為最佳攪拌速度。

圖3　攪拌速度對微載體培養(yǎng)MDCK細胞生長的影響

3.微載體濃度的確定。微載體濃度影響種子細胞的準備量、最高細胞密度、細胞代數(shù)、換液頻率和策略，又因為微載體價格昂貴，對培養(yǎng)成本也有很大影響，所以選擇合適的微載體濃度對大規(guī)模工業(yè)化細胞培養(yǎng)有重要意義。微載體供應商GE公司推薦的微載體濃度為2～3 g/L。本實驗考察了微載體濃度為1 g/L、3 g/L和5 g/L時細胞的生長情況，實驗結果如圖4所示，微載體濃度為1g/L時，不能提供足夠的表面積供細胞生長，細胞受到較嚴重的接觸抑制，56 h時細胞密度只有5.0×105cell/ml；而微載體濃度為3 g/L和5 g/L時，36 h前細胞密度無明顯差別，36～60 h前者細胞密度略高于后者，最高細胞密度分別為1.5×106cell/ml和1.3×106cell/ml。考慮到使用成本，選擇3 g/L作為微載體的使用重量。

圖4　微載體濃度對微載體培養(yǎng)Marc-145細胞生長的影響

4.生物反應器細胞培養(yǎng)代謝分析和灌注策略。在Marc-145細胞進入對數(shù)生長期過程中葡萄糖含量迅速下降到最低值5 mmol/L，代謝乳酸由0 mmol/L快速升高到20 mmol/L，隨著細胞總數(shù)接近最大值，細胞的葡萄糖消耗逐漸趨于穩(wěn)定，同時乳酸含量也下降到一個較低的水平（圖5）。由于1分子葡萄糖完全代謝為乳酸的情況下，可以生成2分子乳酸。在細胞生長期，葡萄糖消耗量略低于乳酸生成量，說明葡萄糖不是完全代謝生成乳酸，低于50%的葡萄糖完全氧化供給細胞能量。因此，在細胞放大培養(yǎng)過程中，早期細胞以葡萄糖代謝產(chǎn)生大量乳酸為特征，灌注培養(yǎng)基以控制乳酸濃度在較低水平為目的，灌注量3～4體積；中后期以細胞維持生存為灌注目的，灌注量1～2體積，逐步減少以達到較高培養(yǎng)基利用率。

圖5　5L生物反應器MDCK細胞葡萄糖、乳酸含量曲線

5.反應器參數(shù)控制。激流式生物反應器的使用方法，按產(chǎn)品使用和操作方法說明進行。反應器運行過程中主要參考設置如表1所示。

表1　反應器培養(yǎng)過程中的控制參數(shù)

（1）PRRSV病毒感染Marc145細胞的條件優(yōu)化。

①病毒感染量（MOI）及收毒時間的確定。不同的感染復數(shù)對PRRSV增殖效價的影響結果如表2所示。過高或過低的感染復數(shù)（5和0.01）均導致較低的PRRSV增殖效價，說明接毒劑量直接影響病毒的增殖效率。感染復數(shù)為0.10時可以獲得最高的PRRSV增殖效價，達到108.0TCID50/ml。此外各組試驗結果均顯示，接毒后48h的病毒效價均高于接毒后72 h的病毒效價，說明接毒后48h可以作為收獲病毒的最適時間。對上述工藝共進行3次驗證，在5L反應器中獲得比較穩(wěn)定的細胞生長及病毒增殖效果，病毒增殖效價均高于108.0TCID50/ml，優(yōu)于傳統(tǒng)的轉瓶生產(chǎn)效價。

表2　不同感染復數(shù)（MOI）對PRRSV增殖效價的影響

②病毒維持液血清濃度的確定。分別選擇1.5%、2%、2.5%血清濃度維持液，培養(yǎng)結束后，分別對含毒細胞培養(yǎng)液的病毒含量進行測定，以確定最佳血清濃度的維持液。

實驗結果見表3，從表3可以看出，血清濃度對病毒的增值有一定的影響，當血清濃度為2%時，病毒含量為107.6TCID50/0.1ml，明顯高于血清濃度為1.5%時的病毒含量。但與2.5%和3.0%比較時，結果差異不顯著，因此選擇血清濃度為2%的維持液培養(yǎng)病毒。

表3　不同血清濃度維持液對病毒增殖的影響

6.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的效力試驗。由表4的結果可以看出，本生產(chǎn)的活疫苗保護率在90%，而轉瓶生產(chǎn)的疫苗保護率為70%，實驗證明病毒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)的活疫苗比轉瓶生產(chǎn)的疫苗有更好的保護效果。

表4　活疫苗對PRRSV強毒攻擊的保護力

三、結論

實驗得出，用懸浮培養(yǎng)制備的活疫苗病毒含量高且免疫保護效果好，通過與傳統(tǒng)轉瓶培養(yǎng)病毒制備的疫苗免疫效果對比，免疫保護效力要顯著優(yōu)于傳統(tǒng)轉瓶制備的活疫苗對豬的免疫保護效力。懸浮培養(yǎng)PRRSV生產(chǎn)方法，體現(xiàn)了連續(xù)培養(yǎng)和規(guī)模化生產(chǎn)動物細胞和病毒的趨勢，與傳統(tǒng)的轉瓶培養(yǎng)工藝相比，具有病毒含量高、抗原效價提高顯著的優(yōu)點，且產(chǎn)品質(zhì)量均一；生產(chǎn)工藝簡化，產(chǎn)量大，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

（略）