響應面法優化蕎麥殼總黃酮超聲輔助萃取工藝

張嵐，于婷婷，孫婉玲，王丹，代偉長

（1.吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林132013；2.吉林省中醫藥管理局二級實驗室，吉林吉林132013；3.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

響應面法優化蕎麥殼總黃酮超聲輔助萃取工藝

張嵐1，2，于婷婷1，孫婉玲1，王丹1，2，代偉長3

（1.吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林132013；2.吉林省中醫藥管理局二級實驗室，吉林吉林132013；3.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

主要研究超聲波輔助萃取蕎麥殼黃酮的影響因素并采用響應面法優化超聲波輔助萃取蕎麥殼黃酮類化合物。通過Placket-Burman試驗考察料液比、乙醇體積分數、提取時間、提取溫度、提取次數對黃酮提取率的影響，影響最為顯著的3個因素進行最陡爬坡試驗，確定中心點；Box-Behnken設計得到最優超聲輔助萃取蕎麥殼黃酮提取條件。蕎麥殼黃酮最佳提取工藝為：料液比1∶49.63（g/mL），提取時間60.53min，提取溫度64.70℃，黃酮得率1.58%。考慮到實際可操作性將實際組合定為：料液比1∶50（g/mL），提取時間60min，提取溫度65℃。驗證在條件下實際黃酮得率為1.581%。

蕎麥殼；總黃酮；響應面；超聲波

我國蕎麥種植面積及產量均較高，資源豐富［1］。蕎麥殼重量約占蕎麥總重的三分之一，在我國，蕎麥殼幾乎得不到有價值的利用，一部分制成蕎麥枕頭，剩余則作為基肥或者焚燒，因此造成很大浪費，不符合可持續發展的價值觀。近年來隨著科技發展及科研的深入，人們發現蕎麥殼富含黃酮類物質，趙玉平等［2］發現蕎麥殼中總黃酮含量為1.67%，郭玉蓉等［3］研究發現苦蕎麥殼黃酮得率為1.7%。因此以蕎麥殼作為原料提取黃酮類化合物有好的開發利用價值。

黃酮類化合物是重要的天然有機化合物，是植物在長期自然選擇過程中產生的一類此生代謝產物［4］。而目前一些相關研究證實，蕎麥黃酮具有多種藥理活性如清除自由基、調節血管活性物質，特別是對糖尿病［5-8］、高血脂癥［9-11］和心血管病［12-15］等具有良好的防治作用。除了上述關于蕎麥黃酮的研究，目前應用于臨床的蕎麥黃酮藥物也很多，例如，復方蕎麥黃酮膠囊（片劑）用于心腦血管病、蕎麥黃酮口腔噴霧劑用于心絞痛的預防和治療、復方蕎麥黃酮噴霧劑用于脫發癥的治療等［16］。

本文采用了近年來在提取工藝上運用比較廣泛的超聲波輔助萃取并結合響應面法優化蕎麥殼中的總黃酮，確定最佳提取工藝參數。

1　材料與方法

1.1材料

吉蕎1號蕎麥殼：吉林農業大學食品科學與工程學院提供。

1.2試劑及配置方法

蘆丁標準品（純度≥98%）：南寧龐博生物工程有限公司；95%乙醇、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

1.3儀器與設備

KQ-100DB型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；722型可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；SHB-111A型循環水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設備有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；AF-20A型密封型搖擺式粉碎機：溫嶺市奧力中藥機械有限公司。

1.4方法

1.4.1蕎麥殼黃酮的提取

將蕎麥殼除雜后鋪在潔凈地面上灑水進行回潮處理，放置2 h～3 h后將蕎麥殼放入高壓鍋121℃高壓處理20 min，將經高壓處理后的蕎麥殼取出用微波干燥，將干燥的蕎麥殼放入搖擺式粉碎機粉碎過60目篩，粉碎過篩后的蕎麥殼密封放置干燥處保存備用。

準確稱取上述處理過的蕎麥殼1.00 g于100 mL錐形瓶中，按一定料液比加入一定體積分數乙醇溶液，在一定溫度、超聲功率下提取一定時間，提取液冷卻后抽濾，旋轉蒸發至干，以95%乙醇定容至100 mL，備用。

1.4.2標準曲線繪制

分別準確吸取蘆丁標準溶液0.0、0.05、0.1、0.2、 0.3、0.4 mL于比色管中，補加95%乙醇至1.5 mL，分別向各試管中加入0.25 mL 4%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min，再分別加入0.25 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置反應6 min，最后各加入1.5 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻。在波長510 nm測定其吸光度值并記錄讀數。以蘆丁濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。Y=0.010 6X，R2=0.999 7

1.4.3黃酮得率計算

黃酮得率計算公式如下。

式中：m為1.0 mL樣品液中黃酮質量，mg；V為樣品液總體積，mL；M為樣品質量，g。

1.4.4超聲輔助萃取蕎麥殼黃酮工藝優化

1.4.4.1Plackett-Burman設計

通過Plackett-Burman設計對可能影響超聲輔助萃取黃酮效果的參數，包括提取次數（A）、乙醇體積分數（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）、料液比（E）進行主效應分析，選用N=5的PB設計，每因素取高（+1）、低（-1）兩水平，以黃酮提取率為指標。PB試驗因素水平設計見表1。

表1　PB試驗因素水平設計表Table 1PB test factor level design table

1.4.4.2最陡爬坡試驗

響應面只有在臨近最佳值時才能建立有效的響應面方程，最陡爬坡法以實驗值變化的梯度方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、經濟地逼近最佳值區域［17］。根據PB試驗結果，確定3個因素及爬坡方向，選擇合理步長，設計最陡爬坡試驗路徑。

1.4.4.3Box-Behnken Design（BBD）優化設計

在PB試驗和最陡爬坡試驗結果的基礎，選擇料液比（X1）、提取時間（X2）、提取溫度（X3）為因素，Box-Behnken Design設計方案見表2。

1.5數據分析

每次試驗重復3次，采用MINITAB16.0軟件進行PB試驗及BBD試驗設計及數據分析。

表2　BBD設計因子及水平表Table 2BBD design factor and horizontal table

2　結果與分析

2.1Placket-Burman試驗結果

PB試驗結果見表3、表4，主效應分析圖見圖1。

表3　Placket-Burman設計實驗及結果Table 3Placket-Burman design experiments and results

表4　PB實驗分析結果Table 4PB experimental results

圖1　主效應圖Fig.1The main effect diagram

通過對效應值的計算，同時利用minitab16軟件對試驗數據進行因子分析t檢驗得到結果如下：

回歸方程為：Y=1.43+0.007 7A-0.017 7B+0.022 8C+ 0.064 2D+0.063 5E

根據表4及主效應圖（圖1）可知，D、E即提取溫度和料液比對蕎麥殼黃酮提取率影響顯著。A、C、D、E為正效應，即提取次數、提取時間、提取溫度及料液比的值越大，蕎麥殼黃酮提取率越高，B為負效應，即乙醇體積分數越大蕎麥殼黃酮提取率越低，最終確定料液比、提取時間、提取溫度為響應面優化的因素。

2.2最陡爬坡試驗結果

最陡爬坡試驗設計及結果見表5。

表5　爬坡試驗設計及結果Table 5Climbing experiments and results

由表5可看出隨著液料比的增大，提取時間的增加及提取溫度的升高，黃酮得率呈現先逐漸增大再減小的趨勢，當料液比為1∶50（g/mL），提取時間為60 min，提取溫度60℃時吸光度最大黃酮含量最多即黃酮得率最高，為3因子的最大響應值區域，因此以試驗號4的各因素水平為中心點值設計下一步響應面試驗。

2.3BBD試驗結果

以料液比1∶50（g/mL），提取時間為60 min，提取溫度為60℃為中心點進行響應面分析，BBD設計及結果見表6，回歸分析結果見表7。

所得回歸方程為：

由表7可知該二次模型多元相關性系數R2= 0.933 6，表明僅有6.64%的不能由此模型解釋，回歸模型P值（Prob＞F）=0.018表明該模型顯著，X1、X3、X12、X22、X1X3均對蕎麥殼黃酮提取率有顯著影響（P＜0.05）。

根據上述擬合方程得到料液比與提取時間交互作用對蕎麥殼黃酮得率的等高線及3D曲面圖，見圖2。

表6　BBD設計及結果Table 6BBD design and results

表7　BBD設計回歸分析Table 7BBD design regression analysis

圖2　料液比及提取時間對蕎麥殼黃酮得率的影響等高線及3D曲面圖Fig.2Influence of 3D surface contour and solid-liquid ratio and extraction time on the yield of buckwheat flavonoids

由圖2可看出當料液比從1∶40（g/mL）增大至1∶60（g/mL），提取時間由55 min增大至65 min的過程中黃酮提取率呈現先增大再減小的趨勢，曲面的頂點即為黃酮提取率最大值。

2.4驗證試驗

Box-Behnken設計進一步優化得出最佳組合43組，其中最優組合工藝條件為：料液比1∶48.75（g/mL），提取時間60.14 min，提取溫度64.74℃，黃酮得率1.58%。考慮到實際可操作性將實際組合定為：料液比1∶50（g/mL），提取時間60 min，提取溫度65℃，經過驗證試驗，該條件下實際黃酮得率為1.581%，與理論最大值接近。說明運用響應面法優化蕎麥殼中總黃酮的提取工藝是可靠的。

3　討論

本試驗選擇的吉蕎1號蕎麥殼黃酮得率為1.581%，與其它研究結果略有出入，熊雙麗等［18］的研究得出在以乙醇為提取溶劑利用索氏提取方法的條件下苦蕎麥殼和甜蕎麥殼的黃酮得率相似，都為1.10%左右。而宋小利等［19］采用超聲提取，確定最優工藝為乙醇體積分數63.73%，料液比1∶21.77（g/mL），提取溫度75℃，提取時間1 h，在上述條件下測得陜北定邊縣甜蕎麥殼中黃酮類化合物的含量為1.03%。樸春紅等［20］的研究得出在乙醇體積分數30%，料液比1∶20（g/mL），提取時間10 min，提取3次條件下內蒙古蕎麥殼黃酮得率為2.381%。這可能由于不同生長環境及生長條件影響蕎麥主要成分的含量，所以黃酮得率有所差別。

在一定提取溫度范圍內隨著提取溫度的升高總黃酮得率也隨之增加，這可能是由于蕎麥殼中總黃酮在乙醇中的溶解度隨溫度的升高而增加，同時由于溫度升高，擴散系數也隨之增大，提取劑滲透力也隨之增強，使有效成分析出速率增大，這與熊雙麗等［18］及宋小利［19］等人研究趨勢相同，但當提取溫度超過一定值時提取率不再增加，甚至有減少趨勢。提取時間也是影響黃酮提取率的因素之一，在一定時間內隨著提取時間的增加黃酮提取率會提高，但超過一定時間后，黃酮得率上升變化緩慢，這與熊雙麗等［18］及樸春紅等［20］的研究趨勢相同。乙醇體積分數及料液比影響黃酮提取率，由主效應圖（圖1）可看出本文中乙醇體積分數為負效應，即隨著乙醇體積分數增大，黃酮提取率隨之減小，與郭玉蓉等［3］的研究趨勢相同，本文乙醇體積分數范圍在40%～60%之間。另外在一定料液比內黃酮得率隨料液比的增大而增大，但超過一定值后總黃酮得率下降，這與楊芙蓮等［21］的研究趨勢相同，且臨界值都為1∶50，當料液比達到1∶50（g/mL）后黃酮析出達到平衡，料液比再繼續增大對黃酮得率影響不大。

4　結論

通過Placket-Burman設計，從5個影響黃酮提取的因素中篩選出3個影響因素：液料比、提取溫度、提取時間，利用最陡爬坡實驗逼近最大響應值區域，再利用Box-Behnken設計進一步優化得出最佳組合：料液比1∶48.75（g/mL），提取時間60.14 min，提取溫度64.74℃，黃酮得率1.58%。考慮到實際可操作性將實際組合定為：料液比1∶50（g/mL），提取時間60 min，提取溫度65℃，實際黃酮得率為1.581%與理論最大值接近，說明運用響應面法優化蕎麥殼中總黃酮的提取工藝是可靠的。

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Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Total Flavonoids from Buckwheat Shell by Response Surface Method

ZHANG Lan1，2，YU Ting-ting1，SUN Wan-ling1，WANG Dan1，2，DAI Wei-chang3
（1.Department of Public and Health，Jinlin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China；2.Level Two Laboratory of Administration of Traditional Chinese Medicine of Jilin Province，Jilin 132013，Jilin，China；3.College of Food Science and Engineering，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，Jilin，China）

This paper studied on the ultrasonic assisted extraction of flavonoids from buckwheat hull main factors and the response surface method was used to optimize the ultrasonic assisted extraction of flavonoids from buckwheat hulls.Through the Placket-Burman experiment investigation material to liquid ratio，volume fraction of ethanol，extraction time，extraction temperature，extraction times on the extraction rate of flavonoids，and to determine the effect of the three significant factors for the steepest ascent experiment，determine the center point；Box-Behnken design got optimal ultrasonic assisted extraction of flavonoids from buckwheat hull extraction conditions.The optimized extraction process was that liquid to solid ratio 1∶49.63（g/mL），extraction time 60.53 min，extraction temperature 64.70℃，flavonoid rate 1.58%.Considering the practical operability，the actual combination was determined as the ratio of material to liquid 1∶50（g/mL），extraction time 60 min，extraction temperature 65℃.After the test，under the optimal extraction condition s of buckwheat flavonoids，the actual extraction rate of flavonoids was 1.581%.

buckwheat shell；total flavonoids；response surface；ultrasonic

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.012

吉林省科技廳青年科研基金項目“蕎麥殼黃酮改善糖基化終產物誘導的氧化應激作用及機制”（20150520133JH）；吉林省教育廳“十三五”科研項目“蕎麥殼黃酮改善2型糖尿病糖代謝及肝糖異生信號轉導通路調控”

張嵐（1980—），女（漢），副教授，博士，研究方向：生物反應器與功能性食品。

2015-12-14