豆粕中大豆異黃酮含量快速測定方法的研究

鮑會梅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院，江蘇淮安223003）

豆粕中大豆異黃酮含量快速測定方法的研究

鮑會梅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院，江蘇淮安223003）

探究豆粕中大豆異黃酮測定的最優(yōu)方法。使用高效液相色譜法測定豆粕中大豆苷、大豆苷元、染料木素3種大豆異黃酮的含量并優(yōu)化其檢測條件。結(jié)果表明，大豆苷、大豆苷元、染料木素含量分別為194.92、14.20、15.42μg/g；RSD都小于0.30%；大豆苷、大豆苷元、染料木素的平均回收率分別為99.55%、99.65%、99.11%，檢測時(shí)，流動相為甲醇∶水∶醋酸（40∶60∶1，體積比）；柱溫為40℃；流速為1.0mL/min。

大豆異黃酮；豆粕；高效液相色譜法

豆粕是大豆油生產(chǎn)工業(yè)的副產(chǎn)品，豆粕中含有大量大豆異黃酮，大豆異黃酮是苯丙烷類代謝途徑的一種次生代謝產(chǎn)物［1］，目前發(fā)現(xiàn)的大豆中異黃酮包括游離型苷元和結(jié)合型的糖苷兩類12種，包括大豆苷（daidzin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）［2］。

大量研究表明，大豆異黃酮與人類健康密切相關(guān)，具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地預(yù)防和抑制白血病、骨質(zhì)疏松、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、婦女更年期綜合癥等多種疾病的發(fā)生，尤其是對乳腺癌和前列腺癌有積極的預(yù)防和治療作用［3］，大豆異黃酮因具有如此多的生物學(xué)活性而越來越受到社會和學(xué)術(shù)界的關(guān)注，是近年來研究的熱點(diǎn)［4］。大豆異黃酮的測定方法有多種，目前主要有高效液相色譜法、紫外薄層色譜法、分光光度法、氣相色譜法等［5］，其中高效液相色譜法是測定大豆異黃酮研究工作中應(yīng)用最為廣泛的一種方法［6］。

采用高效液相色譜法對豆粕中提取出來的大豆苷、大豆苷元、染料木素進(jìn)行測定，并且通過探討其檢測條件，證明該法是一種簡便、快速、準(zhǔn)確、分離效果更好的分析方法。

1　材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

1.1.1儀器

LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津公司），色譜系統(tǒng)包括：Waters600泵；Waters600控制器、光電二極管陣列檢測器（Waters2487photodi-odeArravDeteetor）；在線脫氣機(jī)（Waters In-lineDegasserAF）；Millcnniuln衛(wèi)色譜工作站。

1.1.2色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry Columns Symmetry ShieldTM RP18（5 μm，3.91×150 mm）；流動相∶甲醇∶水∶醋酸=40∶60∶1（體積比）；柱溫：40℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：259 nm。

1.2試劑與材料

試劑：3種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品大豆苷（daidzin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）；甲醇為色譜純；超純水自制；乙醇、丙酮等樣品制備用試劑均為分析純；標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.00 mg/mL）；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（100 μg/mL）。

原料：豆粕購于淮安城南農(nóng)貿(mào)市場。

1.3試驗(yàn)步驟

1.3.1樣品處理

稱取脫脂大豆粕100 g，70℃水浴浸提3 h，乙醇浸提液減壓濃縮，用4 moL/L HCl等電點(diǎn)沉降離心除蛋白，濃縮液稀釋到一定濃度，過大孔樹脂吸附解吸，解吸液濃縮后用丙酮萃取，萃取液濃縮干燥成粉末。準(zhǔn)確稱取1.000 0 g上述方法得到的粉末，轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，加入色譜甲醇接近刻度，常溫超聲波處理30 min，取出，用甲醇定容搖勻，取樣品溶液25 mL置于離心管中，離心20 min（轉(zhuǎn)速3 000 r/min），取上清液濾膜過濾，收集濾液備用。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取0.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00、24.00 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻（配制成0、4、8、12、16、20、24 μg的大豆苷、大豆苷元、染料木素）混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)0.5 μm濾膜過濾后，分別用微量進(jìn)樣器進(jìn)樣，將配制的系列標(biāo)準(zhǔn)液注入高效液相色譜分離。從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，以峰面積Y作因變量，分別以3種標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度X（μg/mL）作自變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3樣品的測定

在優(yōu)化色譜條件下，吸取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品供試液各10 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分離，以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時(shí)間進(jìn)行定性，利用峰面積求出樣液中待測物質(zhì)的含量。

1.3.4結(jié)果計(jì)算

式中：X為樣品中大豆苷/大豆苷元/染料木素的含量，μg/g；A1為樣品峰面積；ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，μg/mL；A2為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積；V為樣品定容體積，mL；m為試樣質(zhì)量g。

2　高效液相色譜法檢測條件的研究

2.1流動相的選擇

流動相是色譜條件中最重要的一項(xiàng)，通過對流動相比例的選擇來達(dá)到最適的分析時(shí)間和最佳的分離效果。在流動相比例分別為甲醇∶水（體積比）=25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50時(shí)，對混合大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行液相色譜測定，選擇最佳流動相比例［7］。

2.2流動相pH值對保留時(shí)間的影響

選擇最佳流動相比例甲醇∶水（體積比）=40∶60時(shí)，酸度的變化能夠調(diào)節(jié)流動相的pH值，本試驗(yàn)選用醋酸進(jìn)行研究，通過分析不同比例的甲醇∶水∶醋酸（體積比）=40∶60∶0、40∶60∶0.5、40∶60∶1、40∶60∶1.5、40∶60∶2、40∶60∶2.5所對應(yīng)的pH值對大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離時(shí)間的比較，最終選出最佳比例。

2.3柱溫的選擇

柱溫對大豆異黃酮成分的保留值以及分離度都有影響。比較了恒流速1 mL/min時(shí)，30、35、40、45、50、55℃6種溫度條件下3種大豆異黃酮成分的保留時(shí)間，選擇最佳的溫度［8］。

2.4線性關(guān)系和檢出值

在上述的優(yōu)化條件下，取不同濃度0、4、8、12、16、20、24 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定6次得一組低濃度標(biāo)準(zhǔn)峰面積，求出其標(biāo)準(zhǔn)偏差，3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以方法的靈敏度，即得方法的最低檢出濃度，得到回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限。

2.5流速的選擇

流速大小直接影響色譜柱及其各成分的分離效果，不同的流速對大豆異黃酮保留時(shí)間會有影響。選取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL/min對樣品標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行液相色譜測定，選取最佳流速。

3　結(jié)果與討論

3.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

根據(jù)上述試驗(yàn)1.3.4，得出大豆苷、大豆苷元、染料木素3種大豆異黃酮與各自峰面積的關(guān)系，結(jié)果見表1、2、3和圖1。

表1　大豆苷進(jìn)樣濃度與峰面積的關(guān)系Table 1Relationship between sample concentration and peak area of soybean

表2　大豆苷元進(jìn)樣濃度與峰面積的關(guān)系Table 2The relationship between the sample concentration and the peak area of soybean

表3　染料木素進(jìn)樣濃度與峰面積的關(guān)系Table 3Relationship between sample concentration and peak area of Genistein

圖1　3種大豆異黃酮進(jìn)樣濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1The standard curve of the sample concentration and peak area of 3 kinds of soybean isoflavone

由圖1可以得到，大豆苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 36 672x-4 059.7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2；大豆苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=47 945x-19 107，相關(guān)系數(shù)R2=0.9985；染料木素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=65 322x-44 982，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 8。根據(jù)公式（1）可得樣品中大豆苷、大豆苷元、染料木素的含量分別為194.92、14.20、15.42 μg/g。

3.2精密度試驗(yàn)

精密吸取10 μL稀釋后的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，分析測定3種大豆異黃酮組分的峰面積，并記錄保留時(shí)間，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析變異系數(shù)，結(jié)果見表4。

表4　3種大豆異黃酮的精密度Table 4The precision of 3 kinds of soybean isoflavone

從表4中可以看出，大豆苷的保留時(shí)間和峰面積的變異系數(shù)分別為0.21、0.20%，大豆苷元的保留時(shí)間和峰面積的變異系數(shù)分別為0.21、0.20%，染料木素的保留時(shí)間和峰面積的變異系數(shù)分別為0.15、1.89%，3種大豆異黃酮的保留時(shí)間和峰面積的變異系數(shù)均小于0.30%，表明本試驗(yàn)建立的色譜條件合理，方法精密度良好。

3.3加標(biāo)樣品回收率

分別精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液4、8、12、16、20、24 μg/mL加入到已得濃度的樣品液中，按上述色譜條件進(jìn)行分析，每個(gè)樣品平行進(jìn)樣6次測定峰面積，計(jì)算平均值，根據(jù)外標(biāo)曲線計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5　3種大豆異黃酮加樣回收率結(jié)果Table 5Results of recovery rate of 3 kinds of Soybean Isoflavones

續(xù)表5　3種大豆異黃酮加樣回收率結(jié)果Continue table 5Results of recovery rate of 3 kinds of Soybean Isoflavones

由表5可知，測定的大豆苷、大豆苷元、染料木素的平均回收率分別為99.55%、99.65%、99.11%，表明該方法準(zhǔn)確度高。

根據(jù)高效液相色譜法測定大豆苷、大豆苷元、染料木素，其保留時(shí)間和峰面積的變異系數(shù)均小于0.30%，回收率分別為99.55%、99.65%、99.11%，在國標(biāo)范圍內(nèi)，所以本文選用高效液相色譜法來測定大豆異黃酮。

3.4檢測條件的選擇

3.4.1流動相比例的選擇

經(jīng)分別選用甲醇∶水（體積比）的比例為25∶75、30∶70、35∶65，40∶60、45∶55、50∶50，結(jié)果見表6。

表6　流動相比例對試驗(yàn)結(jié)果的影響Table 6Effect of flow rate on the experimental results

由表6可看出，隨著甲醇含量的變化，其分離效果改變，當(dāng)甲醇∶水（體積比）=40∶60時(shí)，不僅分離良好、峰形美觀，無拖尾，且分析所用的時(shí)間較短。故選擇流動相的比例為甲醇∶水（體積比）=40∶60。

3.4.2流動相pH值對保留時(shí)間的影響

分別配制40∶60∶0、40∶60∶0.5、40∶60∶1、40∶60∶ 1.5、40∶60∶2、40∶60∶2.5（體積比）的流動相，結(jié)果見表7。

表7　不同流動相比例、pH值及保留時(shí)間Table 7The proportion of different mobile phase，pH value and retention time

由表7可以看出，以醋酸調(diào)節(jié)流動相pH值，pH值越小，分離時(shí)間越短，當(dāng)流動相甲醇∶水∶醋酸（體積比）=40∶60∶1時(shí)，由于醋酸為弱酸，它的含量對pH值影響不大，又考慮到酸對色譜柱的影響，所以，當(dāng)pH值為3.15時(shí)，分離效果較好。

3.4.3柱溫的選擇

選擇溫度分別為30、35、40、45、50、55℃下進(jìn)行試驗(yàn)探討，具體方法見2.3，結(jié)果見表8。

表8　不同柱溫條件下3種異黃酮保留時(shí)間Table 8Retention time of 3 kinds of isoflavones under different temperature conditions

表8表明，隨著柱溫溫度的升高，3種大豆異黃酮的保留時(shí)間越短，保留時(shí)間越短越好，但為了能夠避免較高柱溫，本試驗(yàn)研究選擇溫度為40℃。

3.4.4線性關(guān)系與檢出限

根據(jù)2.4以平行測定6次得一組低濃度標(biāo)準(zhǔn)峰面積，求出其標(biāo)準(zhǔn)偏差，3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以方法的靈敏度，即得方法的最低檢出濃度，檢出限以結(jié)果見表9。

表9　回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 9Regression equation，correlation coefficient，linear range and detection limit

由表9可知，結(jié)果表明3種大豆異黃酮在各線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4.5流速的選擇

根據(jù)2.5試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.6、0.8 mL/min流速較慢分離完全，但保留時(shí)間較長，峰形較差，在1.2、1.4、1.6 mL/min的流速時(shí)雖能縮短分析時(shí)間，但部分化合物的分離度不佳，為保證分離完全，又縮短保留值時(shí)間，確保峰形美觀，流速調(diào)節(jié)到1.0 mL/min較為合適。

4　結(jié)論

采用高效液相色譜法用于測定豆粕中大豆苷、大豆苷元、染料木素3種大豆異黃酮的含量，含量分別為194.92、14.20、15.42 μg/g。高效液相色譜法的RSD均小于0.30%，平均回收率分別為99.55%、99.65%、99.11%，所以本文選擇高效液相色譜法是可靠的。

采用高效液相色譜法快速測定豆粕中大豆苷、大豆苷元、染料木素3種大豆異黃酮的含量，通過對檢測條件進(jìn)行試驗(yàn)最佳結(jié)果的探討，最終得出以下結(jié)論：隨著甲醇含量的變化，其分離效果也改變，當(dāng)甲醇∶水（體積比）=40∶60時(shí)，流動相中pH值對保留時(shí)間有影響，醋酸能夠調(diào)節(jié)流動相pH值，pH值越小，分離時(shí)間越短，最終確定流動相為甲醇∶水∶醋酸（體積比）=40∶60∶1，此時(shí)峰分離良好、峰形美觀，無拖尾，且分析所用的時(shí)間較短；為了能夠避免較高柱溫，在柱溫40℃下，3種大豆異黃酮保留時(shí)間較短；以平行測定得一組低濃度標(biāo)準(zhǔn)峰面積，求出其標(biāo)準(zhǔn)偏差，3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以方法的靈敏度，即得方法的最低檢出濃度，結(jié)果表明3種大豆異黃酮在各線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；為保證分離完全，確保峰形美觀，又能縮短保留值時(shí)間，以1.0 mL/min為最佳流速。

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Soybean Isoflavone Content in Soybean Meal Fast Determination Method of Research

BAO Hui-mei
（School of Food，Jiangsu Food&Pharmaceutical Science College，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

To explorethe optimal methods of soybean isoflavones determination of soybean meal in objective，the use of HPLC determination of 3 Soybean Isoflavones of daidzin，daidzein，genistein in soybean meal and optimize the detection conditions.daidzin，daidzein，genistein content were 194.92，14.20，15.42 μg/g；RSD were less than 0.30%；the average recovery of daidzin，daidzein，genistein was respectively 99.55%，99.65%，99.11%，detection，mobile phase of methanol∶water∶acetic acid（40∶60∶1，volume ratio）；column temperature was 40℃；the flow rate was 1.0 mL/min.

soy isoflavones；soybean meal；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.035

鮑會梅（1974—），女（漢），副教授，碩士，主要從事食品理化檢驗(yàn)教學(xué)工作。

2015-11-21