表面增強拉曼光譜檢測牛奶中三聚氰胺

王琳，王雪，田靜秒，朱華

（北京普析通用儀器有限責任公司，北京101200）

表面增強拉曼光譜檢測牛奶中三聚氰胺

王琳，王雪，田靜秒，朱華

（北京普析通用儀器有限責任公司，北京101200）

建立一種用于檢測三聚氰胺的快速分析方法。采用表面增強拉曼光譜（SERS）分析方法檢測三聚氰胺。該方法的方法檢測限為50ng/mL。該方法的檢測結果受pH的影響，在酸性條件下，三聚氰胺的表面增強拉曼效應較顯著。該方法可以用于檢測牛奶中的三聚氰胺，檢測限為1μg/mL。該方法操作簡便，所用時間短，牛奶前處理與檢測時間一共只需5min，適合現場快速篩查。

表面增強拉曼光譜；三聚氰胺；牛奶

表面增強拉曼光譜技術（SERS）是拉曼光譜技術中的一種，它發展于20世紀70年代。吸附在粗糙化金屬表面的化合物，由于表面局域等離子激元被激發所引起的電磁增強，以及粗糙表面上的原子簇及吸附其上的分子構成拉曼增強的活性點，這兩者的作用使被測定物的拉曼散射產生極大的增強效應。其增強因子可達103～107，已發現能產生SERS的金屬有金、銀等少數金屬。此技術具有選擇性好和靈敏度高的優點，實際檢測限可達10-12克級。因此，SERS技術作為一種新興的定性與定量檢測技術，近年來引起了極大的重視，取得了若干研究進展［1-3］。

三聚氰胺簡稱三胺，學名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚氰酰胺。三聚氰胺（Melamine）是一種重要的氮雜環有機化工原料，是尿素后加工產品［4］。它是白色單斜晶體，具有D3h對稱性［5］。三聚氰胺具有較強的黏性，在機體內的代謝屬于不活潑代謝或惰性代謝［6］，容易在體內吸附形成結石的草酸、鞣酸及鈣等物質，并沉積在泌尿系統中。長期攝入三聚氰胺會造成泌尿系統損害，引起膀胱及腎的結石，并可進一步引起移行性細胞增生進而誘發膀胱癌［7］。乳制品是嬰幼兒的主要食物來源，嬰幼兒代謝能力弱，所以長期食用含有三聚氰胺的食物就會對身體造成危害甚至威脅生命安全。2008年我國發生被三聚氰胺污染的乳制品導致嬰幼兒結石及數起嬰幼兒死亡病例。

綜上，由于三聚氰胺威脅健康，因此禁止被添加到食物中。但是，因為食品工業上普遍采用的、被定為國家標準的檢測生鮮奶蛋白質含量的方法是凱氏定氮法［8］，凱氏定氮法并不是直接檢測蛋白質含量，而是通過測氮含量來推算蛋白質含量。三聚氰胺含氮量高達66%左右，將其混入摻水或劣質生鮮奶中，就可以造成檢測樣品中蛋白質含量達標的假象。因此，不法商家仍然會在牛奶中添加三聚氰胺以牟取利益，因此研究牛奶中三聚氰胺的快速準確的檢測方法十分必要。

表面增強拉曼光譜法檢測牛奶中非法添加三聚氰胺具有操作簡單，快速和高靈敏度的優點，本文采用膠體金顆粒作為表面增強拉曼光譜的增強試劑，研究了采用SERS技術檢測牛奶中非法添加的三聚氰胺的可行性，為進一步研究SERS技術在食品安全領域的應用奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1儀器

手持式拉曼光譜檢測儀（IDRaman mini）（激發光波長785nm，激光輸出功率100mW，光譜范圍400cm-1～2 300 cm-1，光譜分辨率12 cm-1～14 cm-1）：購于海洋光學公司。

1.2材料與試劑

三聚氰胺標準品：購于中國獸藥研究所；氯金酸、檸檬酸三鈉：購于北京科實玻璃儀器有限公司；其他試劑：購于西隴化工股份有限公司。

1.3膠體金制備

采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備膠體金溶液［9］，配制100 mL質量分數為0.02%的氯金酸溶液，邊攪拌邊加熱至沸騰，快速加入3 mL的檸檬酸三鈉溶液，觀察溶液顏色變化，溶液顏色完全變為紅色后開始計時，5 min后停止加熱，使其緩慢冷卻至室溫，加超純水補足體積至100 mL。

1.4表面增強拉曼光譜檢測步驟

首先，檢測待測分子標準品的拉曼圖譜，以該圖譜作為標準圖譜；接著，將40 μL樣品與360 μL增強試劑（膠體金顆粒溶液）放入樣品瓶中，混合，搖勻；再將樣品瓶放入拉曼檢測儀的樣品池中，獲取樣品的拉曼圖譜，將樣品的拉曼圖譜與標準圖譜對比，以能否觀察到特征峰作為能否檢出的判斷依據。

手持式拉曼光譜檢測儀的操作步驟：1）確認儀器中已放入電池，或已連接外接取電設備（如電腦），并且樣品池中沒有樣品瓶，再按下開機按鈕啟動儀器。進入密碼輸入界面，輸入四位數字密碼，按確認鍵。等待儀器自檢結束，進入檢測界面。2）將樣品瓶放入樣品池，或將探頭對準待測樣品，按下確認鍵，再按下運行鍵，接著再按下確認鍵，等待儀器獲得樣品的拉曼圖譜。3）結果界面顯示紅色的樣品圖譜，按下結果界面左下方的儲存鍵，將樣品的拉曼圖譜儲存到儀器中。拉曼圖譜的存儲名稱為檢測時間的小時-分鐘-秒鐘，存儲位置為“SPECTRA”文件夾中檢測日期的文件夾。4）將儀器連接電腦，按下USB鍵，打開“SPECTRA”文件夾，將需要的數據導出。

1.5研究pH對SERS檢測三聚氰胺的影響

取膠體金溶液，不加入三聚氰胺，將pH調節到2.0，7.0或12.0，之后按照1.4的方法進行檢測。

使用去離子水溶解三聚氰胺，配制質量濃度為50 ng/mL的三聚氰胺溶液，將三聚氰胺溶液與膠體金溶液按照體積比1∶9的比例混合均勻，將pH調節到2.0，7.0或12.0，之后按照1.4的方法進行檢測。

1.6研究SERS檢測牛奶中三聚氰胺的方法

取0.5 mL牛奶，加入0.5 mL去離子水，混勻。加入25μL的樣品前處理試劑Ⅰ（106 g/L亞鐵氰化鉀溶液）與25μL的樣品前處理試劑Ⅱ（220 g/L乙酸鋅溶液），混勻，渦旋振蕩30 s至1 min。14 000 r/min離心1 min，取中間清液，使用0.45 μm的濾膜過濾。取過濾后的溶液，與膠體金溶液按照體積比1∶9的比例混合均勻，按照1.4的方法進行檢測。

2　結果與分析

2.1pH對SERS檢測三聚氰胺的影響

膠體金溶液的拉曼圖譜見圖1（a），三聚氰胺的拉曼圖譜見圖1（b）。

圖1　膠體金與三聚氰胺的拉曼圖譜Fig.1Raman atlas of colloidal gold and SERS atlas of melamine

由圖1可見，檢測時調節pH至酸性，可以觀察到三聚氰胺的拉曼特征峰，波數為710 cm-1，由676 cm-1的峰發生紅移而至。推測該峰來自于三聚氰胺分子的對稱骨架伸縮振動［10］。檢測時pH值為中性或堿性，則無法觀察到上述特征峰。說明調節pH值至酸性，能夠引起或促進膠體金對拉曼光譜的增強效應。

三聚氰胺的表面增強圖譜，與三聚氰胺的標準圖譜有區別，984 cm-1特征峰消失，676 cm-1特征峰紅移至710 cm-1。推測三聚氰胺與膠體金顆粒表面發生相互作用，拉曼振動模式有所改變，因此特征峰發生位移或其他變化。

酸性條件下，三聚氰胺的表面增強拉曼效應較顯著。膠體金對待測分子拉曼散射的增強機制，與化學鍵效應（來自于吸附分子與金屬的復合、成鍵）有關，也與電荷轉移效應有關。推測溶液pH變為酸性，影響了三聚氰胺的電性與電荷分布，從而影響了三聚氰胺與膠體金顆粒表面的吸附基團或吸附模式，以及三聚氰胺與膠體金顆粒的拉曼共振效應，因此使膠體金顆粒對三聚氰胺拉曼散射的表面增強作用進一步加強。堿性條件影響不顯著。

本方法檢測三聚氰胺的檢測限為50 ng/mL。

2.2檢測牛奶中的三聚氰胺

市售牛奶，添加不同質量濃度的三聚氰胺，檢測結果見圖2。

圖2　牛奶中三聚氰胺的拉曼圖譜Fig.2SERS atlas of melamine in milk

由圖2可見，牛奶中添加三聚氰胺的質量濃度為1、2、5 μg/mL，可以觀察到三聚氰胺的拉曼特征峰，波數為710 cm-1。說明該方法可以檢測牛奶中非法添加的三聚氰胺。

本方法檢測牛奶中的三聚氰胺，檢測限為1μg/mL。

3　討論

三聚氰胺對生物有重大危害，被三聚氰胺污染的飼料可以導致寵物貓、狗中毒死亡，被三聚氰胺污染的嬰幼兒食品可以導致嬰幼兒腎結石，因此，開發能夠準確迅速的檢測三聚氰胺的方法有重要意義。本研究建立了SERS檢測三聚氰胺的高靈敏方法，方法檢測限為50 ng/mL。本研究還建立了SERS檢測牛奶中三聚氰胺的方法，檢測限為1 μg/mL，該方法操作簡便，所用時間短，牛奶前處理與檢測時間一共只需5 min，試劑穩定，配合手持式或便攜式拉曼光譜儀，適合現場快速篩查。

本文通過研究pH對SERS檢測結果的影響，發現酸性條件下，三聚氰胺的表面增強拉曼效應較顯著，這一研究結果，為進一步研究表面增強拉曼分析的原理與檢測效果奠定了基礎。

［1］EnricaDroghetti，Francesco P Nicoletti，Luca Guandalini，et al.SERS detection of benzophenones on viologen functionalized Ag nanoparticles：application to breakfast cereals［J］.Journal of Raman Spectroscopy，2013，44（10）：1428-1434

［2］Irene Izquierdo-Lorenzo，José Vicente García-Ramos，Santiago Sanchez-Cortes.Vibrational characterization and surfaceenhancedRaman scattering detection ofprobenecid doping drug［J］.Journal of Raman Spectroscopy，2013，44（10）：1422-1427

［3］Benjamin Saute，Radha Narayanan.Solution-based SERS method to detectdithiocarbamate fungicides in differentreal-world matrices［J］. Journal of Raman Spectroscopy，2013，44（11）：1518-1522

［4］謝榮國，武曉宏，楊俊華.飼料中三聚氰胺檢測及其危害［J］.飼料廣角，2008（9）：20-22

［5］馬紅安，趙永年.三聚氰胺（C3N6H6）的高壓Raman與壓致結構相變研究［J］.光散射學報，2005，16（4）：289-294

［6］王錠笙，李學銘，張鵬翔，等.亞單分子層三聚氰胺的便攜式拉曼檢測［J］.光散射學報，2008，20（4）：379-383

［7］佘永新，柳江英，呂曉玲，等.三聚氰胺的毒性及其危害［J］.食品與藥品，2009，11（3）：71-74

［8］中華人民共和國衛生部.GB 5009.5-2010食品安全國家標準食品中蛋白質的測定［S］.北京：中國標準出版社，2010

［9］Frens G.Preparation gold dispersions of varying particle size：controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions［J］.Nature Physical Science，1973，241（17）：20-22

［10］朱自瑩，顧仁敖，陸天虹.拉曼光譜在化學中的應用［M］.沈陽：東北大學出版社，1998：300

Surface Enhanced Raman Spectroscopy（SERS）Assay Method for Melamine in Milk

WANG Lin，WANG Xue，TIAN Jing-miao，ZHU Hua
（Beijing Purkinje General Instrument CO.，LTD.，Beijing 101200，China）

A fast surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）assay method for melamine was developed. The limit of detection of the SERS method was 50 ng/mL.The SERS spectrums under three different pH conditions were studied，and the results showed that the pH of the system had obvious effect on the SERS，and the SERS was most enhanced under acidic condition.For detecting milk，the limit of detection of the SERS method was 1 μg/mL.The SERS method was simple and rapid and could be finished in five minutes.The SERS method could be a convenient tool for field detection of melamine.

surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）；melamine；milk

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.038

王琳（1980—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：快速診斷檢測技術的研究開發和應用等。

2015-11-25