乳酸菌-雙歧桿菌-C+菌組合發酵玫瑰抽提物的探究

李永波，李靜，吳大旺，肖國學

（黔南民族師范學院生命科學與農學學院，貴州都勻558000）

乳酸菌-雙歧桿菌-C+菌組合發酵玫瑰抽提物的探究

李永波，李靜，吳大旺，肖國學

（黔南民族師范學院生命科學與農學學院，貴州都勻558000）

以干玫瑰花蕾為材料，浸提料液質量比1∶4，溫度80℃，提取時間60 min，濃縮溫度60℃～70℃條件下，水抽提玫瑰的干物質得率為15.43%。采用益生菌乳酸菌、雙歧桿菌和C+菌組合發酵，適宜玫瑰飲料配方為：玫瑰干粉5g，檸檬酸0.27 g，白砂糖60 g，蠟質0.1 g，定容至1 000 mL，滅菌后加入無菌維生素C 1 200 mg、混合菌種30 mL。飲料主要營養成分為：小分子有機酸（折合成乳酸）0.021g，氨基酸0.052g，蛋白質0.102g，總糖57.5g。

玫瑰花；飲料；益生菌發酵

食用玫瑰屬薔薇科植物，花含有豐富的蛋白質、多糖、VC、膳食纖維和多種氨基酸等營養物質，富含必需氨基酸和不飽和脂肪酸（亞油酸），總脂肪含量較低［1］。因此，營養結構較好，不僅作為觀賞花卉，還是一種很好的花卉食品資源。目前國內對玫瑰的加工利用主要有以下幾種：干花茶、玫瑰花泡酒、花瓣浸膏、玫瑰干花粉、玫瑰精油提取等利用形式［2-6］，這些初加工產品的使用人群往往有限。如玫瑰花茶，雖然芳香濃郁，但是飲用花茶的人群較小，且利用率較低；泡酒雖然利用率有所提高，但是適宜人群范圍較窄；花瓣浸膏一般用作加工湯圓、糕點、玫瑰糖（玫瑰蕊子）等，缺點是不耐儲藏，且往往由于不良商販違規添加其它成分，以次充好，限制了玫瑰加工食品的推廣。以上種種因素，極大地制約了食用玫瑰產業的發展，因此，開展食用玫瑰的深加工研究具有現實意義。

查閱文獻發現，采用益生菌發酵食用玫瑰的研究鮮見報道，僅有少量相近的研究［5-9］，反映開展該研究工作的價值。采用現代生物抽提技術，通過益生菌發酵，探究生產基于食用玫瑰為原料的玫瑰花飲品，既滿足人們追求健康生活的理念，為深加工食用玫瑰提供借鑒。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1生物質材料

雙歧桿菌、乳酸菌、副干酪乳桿菌（C+菌）：由黔南民族師范學院生物技術與農學院微生物實驗室分離鑒定；干玫瑰花蕾：平陰1號。

1.1.2培養基

菌種活化固體培養基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g～20 g、水1 000 mL、pH 7.0～7.2；種子培養基：玫瑰干粉5 g、蛋白胨5 g、檸檬酸0.27 g、白砂糖60 g、瓊脂15 g～20 g、加水定容至1 000 mL；種子擴大培養基：玫瑰干粉5 g、檸檬酸0.27 g、白砂糖60 g、玫瑰蠟0.1 g、加水定容至1 000 mL，pH自然。

1.1.3試劑

蒸餾水、無水乙醇、檸檬酸、0.1 mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液、1%酚酞指示劑溶液、1.2%茚三酮溶液（20 g/L）、pH=8.04磷酸緩沖液、氨基酸標準溶液（0.5%甘氨酸溶液）、考馬斯亮藍試劑、標準蛋白質溶液、葡萄糖標準液、濃硫酸、蒽酮試劑［10］，以上藥品均為分析純：購自貴州省化學試劑有限公司；

1.1.4主要儀器設備

721型分光光度計：上海現科分光儀器有限公司；HH.S21-8-S型恒溫水浴鍋：上海龍躍儀器設備有限公司；ZXFD-A5430型干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；JYT-5LN型聚能式超聲波提取濃縮機組：上海矩源機械有限公司；TGL-20M離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1玫瑰干粉的制備

稱取玫瑰干花蕾放入提取容器管中，裝入量不低于提取罐的55%且不超過75%；加水提取：花蕾與水的質量比1∶4；提取條件：溫度80、95、100℃，常壓；超聲波攪拌，重復4次～6次至浸出液基本無色時止；濃縮：將玫瑰提取液轉入濃縮罐，在壓力0.15 MPa～0.2 MPa和溫度60℃～70℃下進行減壓蒸發，得濃縮玫瑰浸膏；干燥：將玫瑰浸膏置于60℃的恒溫干燥箱中鼓風干燥至恒重，研磨即得玫瑰干粉，置入冰箱冷藏備用。

1.2.2菌種的活化及擴繁

待試菌種于牛肉膏蛋白胨培養基上活化，種子培養基適應性培養后無菌水洗脫，接種至液體三角瓶，39℃、120 r/min恒溫振蕩培養48 h后使用。

1.2.3益生菌組合發酵試驗

玫瑰干粉5g、檸檬酸0.27g、白砂糖60g、蠟質0.1g、加水定容至1 000 mL，分裝250 mL三角瓶各100 mL滅菌后，每瓶加入無菌維生素C 120 mg并接種組合菌種3 mL，混合菌種體積比：乳酸菌∶雙歧桿菌∶C+=1∶1∶1，總接種體積比1%、3%、5%。于39℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養48 h，連續取樣測定主要成分。

將發酵完畢的玫瑰飲料置于冰箱冷藏后熟過夜，采用問卷調查法在校園內隨機派發自愿品嘗的測試者30人以上，記錄測試對象對發酵飲料的評價。

1.2.4總酸測定［9］

吸取10.0 mL發酵液于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。取10.0 mL稀釋液于10 mL的離心管中，3 000 r/min離心20 min，取上清液置于50 mL的小燒杯中，用0.01 mol/L NaOH滴定至酸度計指示pH=8.2，留空白對照。

1.2.5茚三酮法測定氨基酸含量

查相關文獻根據其背景值［10-11］設計檢測方法：準確吸取200 μg/mL的L-gly標準溶液0.0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL，分別置于10 mL離心管中，加蒸餾水補充至4 mL，各加茚三酮溶液（20 g/L）和磷酸鹽緩沖溶液（pH為8.04）各1 mL，混勻，沸水浴10 min，取出迅速冷至室溫，加水至標線，搖勻。靜置10 min后，在570 nm波長下，以空白為參比液測定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的含量為橫坐標，吸光度A值為縱坐標，繪制標準曲線，分析計算求檢測條件下的回歸方程。

外標法：吸取3 000 r/min、離心20 min的玫瑰發酵飲料上清液1 mL，依次加入上述標準溶液，測混合液的光吸收值。代入方程計算發酵液中游離氨基酸的含量。

1.2.6蒽酮硫酸比色法［12］測定總糖

檢測方法：取7支大試管，各加入0（CK）、10、20、30、40、60、80 μg/mL標準糖液1 mL，蒽酮試劑4 mL，濃硫酸5mL，冰浴冷卻后，管口加蓋統一放入沸水水浴。準確煮沸10 min取出，快速冰浴冷卻至室溫，于620 nm波長下檢測空白及其余各試管吸光值A620。以標準糖含量（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，作出標準曲線，求出回歸方程。外標法測定發酵液糖含量：發酵液離心，吸取0.5 mL，以蒸餾水稀釋搖勻，50 mL容量瓶定容。取0.5 mL發酵稀釋液于上述標準葡萄糖溶液中，測混合液吸光值，重復3次，取平均值代入回歸方程求解。

1.2.7考馬斯亮藍法測定發酵液中的蛋白質［13］

檢測方法：取6支試管，加入不同濃度的標準蛋白溶液：0（CK）、200、400、600、800、1 000 μg/mL各1 mL，加入考馬斯亮藍G-250各5 mL，混勻，于595 nm處比色。以蛋白質含量為橫坐標，A595值為縱坐標，繪制標準曲線，求此條件下的回歸方程。取發酵液1 mL，處理方法同上，測A595值，重復10次，取平均值代入回歸方程計算蛋白質含量。

1.2.8統計分析

氨基酸、蛋白質含量數據分析采用LSD法分析。

2　結果與分析

2.1玫瑰干粉的制備

玫瑰在不同的溫度下所需抽提時間及濃縮效果見表1。

表1　濃縮提取條件與效果Table 1Concentration extraction conditions and enrichment extraction effect

80℃水提取60 min情況下，所得玫瑰干粉顏色好，苦味適中，氣味香濃，得率最大，建議在此條件下提取玫瑰浸膏。

2.2玫瑰抽提物發酵

在菌種加入量不同的情況下，益生菌組合發酵飲料隨機調查品評結果見表2。

表2　乳酸菌-雙歧桿菌-C+菌組合發酵Table 2The combination of lactic acid bacteria and C+bacteria fermentation

結果表明：組合菌種接種量以3%為宜。接種量過少，菌多糖形成量偏少，口感偏甜；接種加大至5%時，發酵速度過快易產生沉淀，酸甜失調。

2.3pH值隨時間的變化曲線

發酵過程中pH值的變化見圖1。

圖1　pH值隨時間變化的曲線Fig.1The pH value curve varied with time

發酵初期發酵液pH值下降快，發酵至10 h pH值降至最低3.95，此后pH值基本不再下降，說明組合菌的產酸代謝基本停止。

2.4總糖隨時間的變化曲線

用蒽酮硫酸法測得玫瑰浸膏中的總糖含量與光吸收值符合下述回歸方程：

其中：X為糖含量，μg/mL；A620為吸光率。

發酵過程中總糖的變化見圖2。

圖2　總糖隨時間變化的曲線Fig.2Change curve of total suger with time

從圖2可知，發酵初期，組合菌的代謝活躍，糖的消耗較快，這在發酵開始的前10個小時變化最明顯。之后，盡管糖含量的總趨勢逐步降低，但變化幅度很小。

2.5氨基酸含量測定分析

用茚三酮法測得游離氨基酸的含量與光吸收值符合下述回歸方程：

式中：Y為游離氨基酸含量，μg/mL；A570為吸光率。發酵液中游離氨基酸含量隨時間變化特點見圖3。

圖3　不同濃度游離氨基酸與茚三酮反應的吸光率（外標法）Fig.3The light absorption rate of different concentrations of free amino acid and ninhydrin reaction（External Standard Method）

2.6蛋白質含量測定分析

標準蛋白經考馬斯亮藍染色后其A570變化曲線如圖4。

用考馬斯亮藍法測得標準蛋白質的含量與光吸收值符合下述回歸方程：P=1 538.5 A570-9.23

式中：P為游離蛋白質含量，μg/mL；A570為吸光率。

將發酵液的吸光率代入回歸方程計算得蛋白質平均含量為0.102 g/L。

圖4　不同濃度的標準蛋白經考馬斯亮藍染色后的吸光率Fig.4The light absorption rates of different concentrations of standard protein dye by Coomassie brilliant blue

2.7對發酵液中游離蛋白質、氨基酸含量的統計分析

LSD法統計分析表明：玫瑰抽提物中游離氨基酸極少，茚三酮法不能直接準確檢測。經混合菌株發酵后，發酵液中游離氨基酸的含量上升明顯，水溶性蛋白質的含量有所下降，具體見表3。

表3　對玫瑰花飲料營養成分進行差異顯著性比較Table 3The differences of nutritional components in rose beverage were compared

3　結論與討論

3.1結論

干玫瑰花苞在浸提料液質量比1∶4，溫度80℃，時間60 min，濃縮溫度60℃～70℃，水抽提玫瑰干物質得率為15.42%。玫瑰花飲料配方：玫瑰干粉5 g，檸檬酸0.27 g，白砂糖60 g，蠟質0.1 g，菌種30 mL。每1 000 mL飲料主要營養成分含量：小分子有機酸（折合成乳酸）0.021 g，氨基酸0.052 g，總糖57.5 g，蛋白質0.102 g。

3.2討論

水提取玫瑰干粉的主要影響因素有浸提時間和溫度，浸提溫度愈高，雖得率也相當，耗時短，但香味損失重。發酵飲料中有機酸含量折合乳酸計算得0.021 g/L，由于乳酸的電離度比其它有機酸大，故實際酸含量要大些。發酵至10 h pH值降至最低3.95，此后pH值基本不再下降，說明組合菌的產酸代謝基本停止，推測pH值已對菌體生長活動產生抑制，但是此時發酵液中的糖含量仍在緩慢下降，造成飲料口感越來越酸。經益生菌發酵，游離氨基酸的含量上升明顯，水溶性蛋白質的含量有所下降，說明通過發酵飲料中的鮮味物質增加，較好地改善了口感。

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Lactobacillus-Bifidobacterium-Lactobacillus Paracasei Combined Fermentation of Rose Beverage

LI Yong-bo，LI Jing，WU Da-wang，XIAO Guo-xue
（Academy of Life Science and Agriculture，Qiannan Normal College for Nationalities，Duyun 558000，Guizhou，China）

Using dry rose bud，extraction of solid-liquid mass ratio 1∶4，temperature 80℃，extracting time 60 min，concentrated temperature 60℃-70℃，the extraction yield of rose is 15.43%by water.The probiotic fermentation with lactobacillus，bifidobacterium and combination C+bacteria，appropriate rose beverage recipe for：rose powder 5 g，citric acid 0.27 g，granulated sugar 60 g，wax 0.1 g，the capacity to 1 000 mL，sterilization. Then joining 1 200 mg of vitamin C，30 mLmixed bacteria.Main nutrition of drinks are as follows：small molecule organic acids（converted into lactic acid）0.021 g，amino acid 0.052 g and protein 0.102 g，total sugar 57.5 g.

rose；drink；probioticfermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.040

貴州省科技廳項目（S2016JP00401745313）；貴州省科技廳項目（黔科合LH［2012］7427）；黔南民族師范學院微生物學院級重點學科項目（zdxk2011-09）

李永波（1976—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：應用微生物學。

2016-06-06