激光免疫療法對多發性皮膚鱗狀細胞癌小鼠的抗腫瘤效應研究

羅敏 石磊 張付賀 陳偉 王秀麗

200443 上海，安徽醫科大學上海皮膚病臨床學院（羅敏、張付賀、王秀麗）；上海市皮膚病醫院、同濟大學醫學院光醫學研究所（石磊、陳偉）

激光免疫療法對多發性皮膚鱗狀細胞癌小鼠的抗腫瘤效應研究

羅敏 石磊 張付賀 陳偉 王秀麗

200443 上海，安徽醫科大學上海皮膚病臨床學院（羅敏、張付賀、王秀麗）；上海市皮膚病醫院、同濟大學醫學院光醫學研究所（石磊、陳偉）

目的探討激光免疫療法對多發性皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）小鼠的抗腫瘤效應。方法用紫外線持續照射SKH?1無毛小鼠建立免疫功能正常的小鼠多發性皮膚鱗癌模型后，分成激光免疫組、激光組、咪喹莫特組和對照組（每組5只）。激光免疫組：聯合外用咪喹莫特乳膏及808 nm激光照射；激光組：僅予808 nm激光照射；咪喹莫特組：僅予咪喹莫特乳膏外用；對照組不予任何處理。治療后記錄小鼠瘤體體積、生存情況和腫瘤形態學變化。第27、60天用t檢驗和Mantel?Cox logrank檢驗兩兩比較4組小鼠背部瘤體體積和生存率。另取12只鱗癌小鼠分成4組，每組3只，治療后第5天，取瘤體組織進行病理學觀察。結果第27天時，對照組和咪喹莫特組瘤體體積均較治療前明顯增大（均P＜0.05），激光組和激光免疫組瘤體無明顯增大（均P＞0.05），其中咪喹莫特組瘤體體積略小于對照組（P＞0.05），而激光組和激光免疫組瘤體體積明顯小于對照組（均P＜0.05）。第60天時激光組瘤體體積增大，體積明顯大于激光免疫組（P＜0.05）。對照組小鼠在40 d內全部死亡；咪喹莫特組小鼠在50 d內全部死亡；激光組小鼠在第52、53天分別死亡1只，余存活60 d以上；激光免疫組小鼠在60 d內無死亡。第60天與對照組比較，咪喹莫特小鼠生存時間稍有延長，差異無統計學意義（P＞0.05）；激光組和激光免疫組小鼠生存時間明顯延長（均P＜0.05），但激光免疫組與激光組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。組織病理學顯示咪喹莫特外用5 d無細胞死亡，而激光組及激光免疫組細胞大量死亡，瘤周可見多種炎癥細胞，較對照組明顯增多，尤以激光免疫組更明顯。結論激光免疫療法是一種安全且有效的治療皮膚鱗癌方法，尤其對多發性或轉移性皮膚鱗癌具有潛在價值。

腫瘤，鱗狀細胞；激光；免疫；小鼠

皮膚鱗狀細胞癌（簡稱鱗癌）是常見的皮膚腫瘤之一。皮膚鱗癌病因復雜，長期紫外線照射是最主要的誘因之一［1］。手術、放療、化療等傳統方法治療鱗癌存在不良反應大、治療后容易復發、復發后再次治療困難等問題，尤其是多發性及轉移性鱗癌的治療非常棘手，亟需開發新的治療方法［1?2］。激光免疫療法是一種腫瘤治療方法，通過聯合光熱治療和免疫佐劑協同發揮抗腫瘤作用［3］，目前已在晚期轉移性乳腺癌和皮膚黑素瘤的臨床治療中取得了較為理想的療效［4?5］。本研究以紫外線誘導的多發性皮膚鱗癌小鼠為動物模型，初步研究激光免疫療法對多發性皮膚鱗癌小鼠的抗腫瘤作用。

資料與方法

一、資料

1.動物：SKH?1無毛小鼠，具有完整的免疫系統。從美國Jackson實驗室引進，由復旦大學上海市公共衛生中心清潔級動物飼養室負責繁殖和飼養（許可證號SCXK滬2015?0002），室溫20～24℃，給予標準顆粒飼料和水飼養。實驗選擇6～8周齡的雌性小鼠。

2.儀器與試劑：SS?03B型UV?B光療儀（只含10%UVB和90%UVA）、UVB輻照計（上海希格瑪高技術有限公司）。半導體激光器，波長為808 nm（FC?W?808?20w?13565，長春新產業光電技術有限公司），微透鏡光纖（Batch：ML0210，美國 Pioneer Optics公司）。5%咪喹莫特乳膏（0.25 g：12.5 g，四川明欣藥業有限責任公司）。

二、方法

1.紫外線誘導多發性皮膚鱗癌小鼠模型的建立：SS?03B型UV?B光療儀開機后待輸出功率穩定，每次取5只小鼠，暴露于上述光源下進行照射，照射光源距小鼠背部皮膚垂直距離30 cm，光線覆蓋小鼠整個背部。不照射期間正常飼養。照射起始劑量依據最小紅斑量（MED）決定，即采用自制MED測量板［6］，選擇3只SKH?1小鼠進行檢測，照射光源距小鼠背部皮膚垂直距離30 cm，觀察不同劑量紫外線照射1次后24 h照射部位的皮膚反應，出現肉眼可見紅斑的最小照射劑量即為MED值。照射劑量為第1、2周采用90%MED劑量照射，每周連續照射5次，第3周按每兩周增加15%MED，第9周按每兩周增加7.5%MED，第11周后維持劑量至實驗結束。照射期間仔細觀察小鼠皮膚變化，根據本課題組既往研究［6］，小鼠瘤體直徑達1～4 mm且持續存在2周以上建模成功。

2.實驗分組及處理：取20只成功建模的鱗癌小鼠，分為激光免疫組、激光組、咪喹莫特組和對照組（每組5只）。激光免疫組：第1～3、5～7天予局部外涂咪喹莫特乳膏，每天1次，第4天予808 nm近紅外激光照射（1 W/cm2，10 min），激光免疫組治療1次療程為7 d，每次治療間隔為7 d，共治療3次。照光治療：通過微透鏡光纖對小鼠背部腫瘤進行非侵入性照射，功率密度為1 W/cm2，照射時間為10 min，光斑面積以覆蓋腫瘤周圍2～5 mm為準。激光組：僅在第4、18、32天給予808 nm激光照射（1 W/cm2，10 min）。咪喹莫特組：連續局部外涂咪喹莫特乳膏7 d為1次治療，每次治療間隔7 d，共治療3次。以上3組每次均選擇小鼠背部體積最大的3處瘤體進行治療。對照組不予任何處理。

3.抗腫瘤效應評價：從治療當天至治療開始后第60天，每天觀察小鼠的瘤體體積變化、腫瘤形態學變化及生存情況。瘤體體積觀察：每3、4天以精密電子游標卡尺測量瘤體的最大長徑和垂直短徑，在Excel表中按公式V=ab2/2（V為體積，a為長徑，b為短徑）計算每只小鼠背部所有直徑＞1 mm的瘤體體積之和，取每組均值繪制瘤體體積變化曲線。小鼠死亡時瘤體體積不再計算。第27天比較4組體積變化。腫瘤形態學觀察：每3、4天以佳能G15相機采集小鼠大體照片，對比觀察4組小鼠腫瘤形態學變化。生存情況：觀察小鼠生命體征及一般情況，當小鼠瘤體直徑＞15 mm、出現明顯潰瘍（直徑＞10 mm）、惡病質或腹水時終止研究，對小鼠行安樂死。生命體征消失或病情加重符合安樂死標準均視為小鼠死亡，記錄小鼠死亡情況與死亡時間，統計4組小鼠生存率，第60天比較4組生存率。

4.腫瘤組織病理學變化：另取12只成功建模的鱗癌小鼠，按照前述方法隨機分成4組，每組3只，均于治療后第5天，對小鼠行安樂死，取治療部位瘤體組織用4%甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察腫瘤組織病理學變化。

5.統計學分析：用SPSS13.0統計軟件進行分析。采用t檢驗統計小鼠瘤體體積數據，采用Mantel?Cox logrank統計小鼠生存率數據，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.瘤體體積變化：記錄小鼠瘤體體積，繪制小鼠瘤體體積變化曲線，見圖1。治療前，4組小鼠的瘤體體積差異無統計學意義。治療后，對照組和咪喹莫特組小鼠瘤體體積逐漸增大，第27天2組瘤體體積顯著大于治療前（均P＜0.05），激光免疫組和激光組瘤體體積無明顯增大（均P＞0.05）。其中，咪喹莫特組瘤體體積略小于對照組（P＞0.05）；激光組和激光免疫組瘤體體積明顯小于對照組（均P＜0.05），而激光免疫組與激光組間差異無統計學意義（P＞0.05）。第60天對照組和咪喹莫特組小鼠已全部死亡；激光組小鼠瘤體體積逐漸增大，瘤體體積明顯大于激光免疫組（P＜0.05）。

圖1 4組小鼠瘤體體積變化曲線每個點代表均數

2.腫瘤形態學變化：用相機采集小鼠大體照片，觀察4組小鼠腫瘤形態學變化，見圖2。治療前可見4組小鼠背部均散在數個直徑1～4 mm瘤體。治療開始后，對照組小鼠背部瘤體逐漸增多增大，第4周時可見瘤體明顯增大增多，部分瘤體密集成片狀分布，部分瘤體融合成較大的腫瘤，部分瘤體中央破潰壞死，形成潰瘍或痂皮并伴有臭味。第6周小鼠已全部死亡。咪喹莫特組小鼠局部涂藥部位出現少量鱗屑，背部瘤體仍逐漸增大增多，其余瘤體形態變化與對照組相似。激光組小鼠在照光后24 h照光部位瘤體表面輕度結痂，1周左右痂皮脫落，部分瘤體減小甚至消退，但18 d后開始復發，而未治療瘤體繼續增大增多，第4周可見瘤體明顯增大增多，第6周瘤體更大更多。激光免疫組外涂咪喹莫特后局部皮膚出現鱗屑，激光照射后24 h照光部位瘤體表面發黑結痂，1、2周黑痂脫落。第4周可見明顯黑痂，伴少量小瘤體，第6周可見單個0.5～32 mm3的瘤體經治療后基本痊愈，部分殘留瘢痕，觀察至第60天未見復發；單個體積＞171.5 mm3的瘤體經治療后仍殘留腫瘤組織，未治療瘤體生長亦緩慢，周圍正常組織未見明顯異常變化。

3.小鼠生存情況：對照組小鼠在實驗開始后的第12天（1只）、第28天（2只）、第32天（1只）、第39天（1只）分別死亡。咪喹莫特組小鼠在實驗開始后的第33、42、45、48、50天分別死亡1只。激光組小鼠在實驗開始后的第52、53天分別死亡1只。激光免疫組小鼠在實驗開始后60 d內無死亡。第60天時，與對照組比較，咪喹莫特組小鼠生存時間稍有延長（P＞0.05），激光組和激光免疫組小鼠生存時間明顯延長（均P＜0.05），但激光組與激光免疫組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

4.組織病理學：對照組及咪喹莫特組細胞異形性明顯，排列密集，無細胞死亡，可見角化珠。激光組及激光免疫組細胞大量死亡，瘤周可見多種炎癥細胞，較對照組明顯增多，尤以激光免疫組更明顯。見圖3。

圖2 4組小鼠腫瘤形態學變化 治療前4組小鼠背部均散在數個直徑1～4 mm瘤體。治療后，對照組小鼠背部瘤體逐漸增多增大，第4周瘤體明顯增大增多，第6周小鼠已全部死亡。激光組小鼠部分治療瘤體縮小甚至消退，但18 d后復發，而未治療瘤體仍繼續增大增多，第4周瘤體明顯增大增多，第6周瘤體更大更多。咪喹莫特組小鼠背部瘤體逐漸增大增多，瘤體形態變化與對照組相似。激光免疫組第4周可見明顯黑痂，伴少量小瘤體，第6周可見單個體積為0.5～32 mm3的瘤體經治療后基本痊愈，部分殘留瘢痕；單個體積＞171.5 mm3的瘤體經治療后仍殘留腫瘤組織，未治療瘤體生長亦緩慢，周圍正常組織未見明顯異常變化

圖3 4組小鼠瘤體在治療后第5天組織病理學變化（HE×200） 對照組及咪喹莫特組細胞排列密集，無細胞死亡；激光組及激光免疫組細胞大量死亡，伴多種炎癥細胞，尤以激光免疫組更明顯

討 論

研究認為，腫瘤最終能否被治愈、治療后腫瘤是否會復發，很大程度上與宿主的免疫監視和免疫防御能力相關［7］。由于鱗癌的免疫原性弱，老年患者的免疫功能低下等無法誘導宿主產生有效的抗腫瘤免疫應答，是鱗癌復發、侵襲、轉移的重要原因之一［8］。因此，尋找一種理想的抗腫瘤療法，在殺傷鱗癌細胞的同時能有效激活宿主免疫，是非常重要的。激光免疫療法主要是通過近紅外激光局部照射腫瘤組織直接殺傷腫瘤細胞，同時聯合免疫佐劑誘導宿主抗腫瘤免疫［9］。該療法在治療乳腺癌和皮膚黑素瘤方面取得了理想的療效，不僅治療部位腫瘤均有改善，未經直接治療的轉移瘤也有改善，該結果提示激光免疫療法可有效誘導系統免疫效應，是一種有前途的腫瘤免疫治療方法。

本研究以808 nm近紅外激光為光源，咪喹莫特為免疫佐劑構建的激光免疫療法治療皮膚鱗癌小鼠。我們前期預實驗結果和陳偉既往相關實驗結果［10?11］顯示，808 nm近紅外激光照射10 min既能有效抑制腫瘤生長，又不產生明顯的燙傷損害，因此本研究選用功能密度為1 W/cm2的808 nm近紅外激光照射10 min。本文結果顯示，單純外涂咪喹莫特稍能延緩小鼠瘤體體積增長，提高小鼠生存率，與既往文獻［12?13］相比，本文小鼠外涂咪喹莫特療程較短，所以療效略差。單純激光照射治療鱗癌小鼠時，照射部位瘤體體積縮小，部分甚至消退，與對照組相比，單純激光治療能延緩瘤體生長，提高小鼠生存時間，說明單純激光治療有一定的療效。而將激光和咪喹莫特聯合治療即激光免疫治療時，能明顯提高小鼠的生存率，不僅能抑制治療部位的瘤體，對未治療部位的瘤體亦有明顯抑制作用，療效明顯優于激光組。治療期間周圍正常組織無明顯影響，小鼠亦無明顯不良反應，可見激光免疫療法是一種安全有效的抗皮膚鱗癌治療方法，尤其是對多發性或伴有轉移的皮膚鱗癌具有較大的潛在應用價值。然而，本研究也發現，激光免疫療法雖然對0.5～32 mm3的小體積鱗癌療效顯著，但是不能徹底清除＞171.5 mm3的鱗癌，可能不適用于大體積皮膚鱗癌治療。本文組織病理顯示單純激光照射能直接促使腫瘤細胞大量死亡，聯合咪喹莫特能進一步促使腫瘤細胞死亡，增加腫瘤周圍炎癥細胞浸潤，從組織病理層面進一步證明了激光免疫療法的有效性及免疫效應。

［1］Kallini JR,Hamed N,Khachemoune A.Squamous cell carcinoma of the skin:epidemiology,classification,management,and novel trends［J］.Int J Dermatol,2015,54（2）:130?140.DOI:10.1111/ijd.12553.

［2］Ratushny V,Gober MD,Hick R,et al.From keratinocyte to cancer:the pathogenesis and modeling of cutaneous squamous cell carcinoma［J］.J Clin Invest,2012,122（2）:464 ?472.DOI:10.1172/JCI57415.

［3］Chen WR,Singhal AK,Liu H,et al.Antitumor immunity induced by laser immunotherapy and its adoptive transfer［J］.Cancer Res,2001,61（2）:459?461.

［4］Li X,Ferrel GL,Guerra MC,et al.Preliminary safety and efficacy results of laser immunotherapy for the treatment of metastatic breast cancer patients［J］.Photochem Photobiol Sci,2011,10（5）:817?821.DOI:10.1039/c0pp00306a.

［5］Li X,Naylor MF,Le H,et al.Clinical effects of in situ photo?immunotherapy on late?stage melanoma patients:a preliminary study［J］.Cancer Biol Ther,2010,10（11）:1081 ?1087.DOI:10.4161/cbt.10.11.13434.

［6］呂婷,王秀麗,周文江,等.紫外線所致皮膚鱗狀細胞癌小鼠模型的建立［J］.中華皮膚科雜志,2011,44（3）:174?177.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2011.03.008.Lu T,Wang XL,Zhou WJ,et al.Establishment of mouse model for cutaneous squamous cell carcinoma induced by ultraviolet［J］.Chin J Dermatol,2011,44（3）:174 ?177.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2011.03.008.

［7］Mellman I,Coukos G,Dranoff G.Cancer immunotherapy comes of age［J］.Nature,2011,480（7378）:480 ?489.DOI:10.1038/nature10673.

［8］Wang X,Ji J,Zhang H,et al.Stimulation of dendritic cells by DAMPs in ALA ?PDT treated SCC tumor cells［J］.Oncotarget,2015,6（42）:44688?44702.DOI:10.18632/oncotarget.5975.

［9］Zhou F,Li X,Naylor MF,et al.InCVAX:a novel strategy for treatment of late?stage,metastatic cancers through photoimmuno?therapy induced tumor?specific immunity［J］.Cancer Lett,2015,359（2）:169?177.DOI:10.1016/j.canlet.2015.01.029.

［10］Chen WR,Adams RL,Carubelli R,et al.Laser?photosensitizer assisted immunotherapy:a novel modality for cancer treatment［J］.Cancer Lett,1997,115（1）:25?30.

［11］Naylor MF,Chen WR,Teague TK,et al.In situ photoimmu?notherapy:a tumour?directed treatment for melanoma［J］.Br J Dermatol,2006,155（6）:1287?1292.DOI:10.1111/j.1365?2133.2006.07514.x.

［12］Yokogawa M,Takaishi M,Nakajima K,et al.Imiquimod attenuates the growth of UVB?induced SCC in mice through Th1/Th17 cells［J］.Mol Carcinog,2013.52（10）:760 ?769.DOI:10.1002/mc.21901.

［13］Jeon HC,Choi M,Paik SH,et al.Treatment of keratoacanthoma with 5%imiquimod cream and review of the previous report［J］.Ann Dermatol,2011.23（3）:357?361.DOI:10.5021/ad.2011.23.3.357.

Antineoplastic effect of laser immunotherapy in mice with multiple cutaneous squamous cell carcinoma

Luo Min,Shi Lei,Zhang Fuhe,Chen Wei,Wang Xiuli
Shanghai Skin Disease Clinical College of Anhui Medical University,Shanghai 200443,China（Luo M,Zhang FH,Wang XL）;Shanghai Dermatology Hospital,Institute of Photomedicine,Tongji University School of Medicine,Shanghai 200443,China（Luo M,Shi L,Zhang FH,Chen W,Wang XL）;Biophotonics Research Laboratory,University of Central Oklahoma,Edmond 73034,USA（Chen W）

ObjectiveTo evaluate the antineoplastic effect of laser immunotherapy in mice with multiple cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）.MethodsNormal immunocompetent hairless SKH ?1 mice were consecutively irradiated by ultraviolet rays to establish mouse models of multiple CSCC.Then,20 CSCC?bearing mice were randomly and equally divided into 4 groups:laser group irradiated with an 808?nm near?infrared laser（1 W/cm2,10 minutes）once every two weeks for a total of 3 sessions,laser immunotherapy group irradiated with an 808?nm near?infrared laser as above and topically treated with imiquimod cream once a day for 3 days before and after each session of irradiation,imiquimod group treated with imiquimod cream as in the laser immunotherapy group,and control group receiving no treatment.The volume of tumors was calculated,and their morphology as well as the survival of mice were observed after the treatment.Thettest and Mantel?Cox log?rank test were used to compare the volume of tumors on the dorsum and survival rates of mice,respectively,on days 27 and 60 after the start of treatment.Another 12 CSCC?bearing mice were randomly and equally divided into the 4 groups mentioned above,and tumor tissues were resected from these mice for histopathological examination on day 5 after the first treatment.ResultsOn day 27,the volume of tumors significantly increased in the control group and imiquimod group（bothP＜ 0.05）,but experienced no significant increase in either of the other two groups compared with that before the start of treatment（bothP＞0.05）.Moreover,the volume of tumors in the control group was slightly larger than that in the imiquimod group（P＞0.05）,but significantly larger than that in the laser group and laser immunotherapy group（bothP＜ 0.05）.The volume of tumors in the laser group increased,and was significantly larger than that in the laser immunotherapy group on day 60（P＜ 0.05）.Mice all died within 40 days in the control group,and within 50 days in the imiquimod group;one mouse died on days 52 and 53 separately,and the other mice all survived longer than 60 days in the laser group;no mice died within 60 days in the laser immunotherapy group.By day 60,the survival time of mice was slightly longer in the imiquimod group（P＞0.05）,significantly longer in the laser group and laser immunotherapy group compared with the control group（bothP＜ 0.05）,but similar between the laser group and laser immunotherapy group（P＞0.05）.Histopathological examination showed that 5?day topical application of imiquimod cream did not cause death of tumor cells,but numerous tumor cells died in the laser group and laser immunotherapy group.Multiple inflammatory cells were observed around the tumors,and the number of the inflammatory cells was obviously larger in both the laser group and laser immunotherapy group,especially in the latter group,compared with the control group.ConclusionLaser immunotherapy is a new effective and safe treatment for CSCC in mice,and has potential value especially in the treatment of multiple or metastatic CSCC.

Neoplasms,squamous cell;Laser;Immunity;Mice

Wang Xiuli,Email:xlwang2001@aliyun.com

2016?04?07）

（本文編輯：吳曉初）

王秀麗，Email：xlwang2001@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.09.004

國家自然科學基金（81472796、81272990）；上海市青年科技英才揚帆計劃項目（15YF1410700）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81472796，81272990）;Yang Fan Program of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality（15YF1410700）