念珠地絲菌對五種抗真菌藥的體外敏感性及電鏡觀察

武麗寧 李晨 王丹 曹冰蘭 朱敬先

050011 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院皮膚科（武麗寧、朱敬先）；石家莊市第五醫(yī)院感染科（李晨）；承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科（王丹）；河北省元氏縣中醫(yī)院皮膚科（曹冰蘭）

念珠地絲菌對五種抗真菌藥的體外敏感性及電鏡觀察

武麗寧 李晨 王丹 曹冰蘭 朱敬先

050011 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院皮膚科（武麗寧、朱敬先）；石家莊市第五醫(yī)院感染科（李晨）；承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科（王丹）；河北省元氏縣中醫(yī)院皮膚科（曹冰蘭）

目的探討5種臨床常見抗真菌藥對念珠地絲菌的體外抑制作用，并觀察用藥后念珠地絲菌的形態(tài)學(xué)變化。方法5種臨床常見抗真菌藥為特比萘芬、兩性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康唑。參照美國國家臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)修訂的M27?A2方案及相關(guān)文獻(xiàn)，測定各藥物對念珠地絲菌的MIC值。應(yīng)用掃描電鏡觀察特比萘芬作用后念珠地絲菌的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果5種藥物對念珠地絲菌的MIC值依次為：特比萘芬0.01 μg/ml、兩性霉素B 0.4 μg/ml、氟胞嘧啶2 μg/ml、氟康唑2.69 μg/ml、伊曲康唑 0.25 μg/ml。念珠地絲菌對特比萘芬、兩性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑均敏感，對伊曲康唑?yàn)閯┝恳蕾囆悦舾小呙桦婄R可見，經(jīng)特比萘芬作用后念珠地絲菌菌體表面出現(xiàn)粗糙、皺縮、不規(guī)則缺損及孔洞，甚至呈碎片狀。結(jié)論特比萘芬對念珠地絲菌的抗菌活性最顯著，在一定范圍內(nèi)，特比萘芬濃度越高，念珠地絲菌被破壞的程度越嚴(yán)重。

地絲菌屬；念珠菌屬；體外研究；微生物敏感性試驗(yàn)；顯微鏡檢查，電子，掃描；念珠地絲菌

念珠地絲菌（Geotrichum silvicola），舊稱林生地霉，是新發(fā)現(xiàn)的一種罕見地絲菌［1］，是無性繁殖，產(chǎn)生關(guān)節(jié)孢子的雙相酵母樣真菌。2002年，首次從巴西的果蠅和印度柞蠶幼蟲身上分離出。2002年、2005年我們相繼從1例膿癬患兒皮損和1例中毒性表皮壞死松解癥患者的血液中分離到念珠地絲菌［2?3］，兩者分別應(yīng)用特比萘芬及伊曲康唑輔以大蒜素注射液，均取得良好療效。黃文明等［4］從l例足部潰瘍患者的膿液中分離出該菌，經(jīng)伊曲康唑治療后好轉(zhuǎn)。朱敬先等［2?3，5?9］已對該菌進(jìn)行了一系列的研究包括其形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)及其致病性的初步探討。我們通過體外藥敏試驗(yàn)，旨在觀察念珠地絲菌感染的有效治療藥物，并通過電鏡進(jìn)一步觀察念珠地絲菌被藥物破壞后的微觀形態(tài)學(xué)變化，為今后的臨床工作提供依據(jù)。

資料與方法

一、資料

1.實(shí)驗(yàn)菌株：念珠地絲菌（保藏號(hào)CGMCC2.3078）由我科臨床分離所得，由中國科學(xué)院微生物研究所鑒定，近平滑念珠菌（ATCC22019）購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

2.主要試劑：特比萘芬（TER）、兩性霉素B（AmB）、氟胞嘧啶（FC）、氟康唑（FCZ）、伊曲康唑（ICZ）均購于中國食品藥品檢定研究院，二甲基亞砜（DMSO）購于天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心。

3.培養(yǎng)基：改良沙氏培養(yǎng)基（SDA），RPMI 1640液體培養(yǎng)基購于上海立菲生物技術(shù)有限公司。

二、方法

1.菌懸液的制備：將凍存的念珠地絲菌及質(zhì)控菌株近平滑念珠菌在常溫下復(fù)蘇2～3 d，轉(zhuǎn)種于改良沙氏培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)1周。選擇生長良好的菌落，用無菌的生理氯化鈉溶液沖洗培養(yǎng)基斜面，并用3～4層紗布過濾，分別在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上調(diào)節(jié)孢子濃度至（1～5）×108cfu/ml，用RPMI 1640培養(yǎng)基先按照1∶20稀釋菌懸液，再按照1∶50稀釋，得到濃度為（1～5）×105cfu/ml的念珠地絲菌菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液作為接種物。

2.藥液的配制：準(zhǔn)確稱取藥粉，AmB及ICZ用蒸餾水溶解，劇烈振蕩使其溶解，得到濃度為640 μg/ml的藥液。同樣，F(xiàn)C及FCZ溶于蒸餾水中配制成濃度為1 280 μg/ml的藥液。TER先用DMSO溶解，再以蒸餾水稀釋得到濃度為1.6 μg/ml的藥液，DMSO的終濃度不得超過1%［5］。用RPMI 1640液體培養(yǎng)基，采取倍比稀釋法，將以上貯存液以2倍梯度稀釋，最終得到2倍于終濃度的藥液。即AmB、ICZ最終接種濃度為（0.031 3～16）μg/ml，F(xiàn)C、FCZ最終接種濃度為（0.125～ 64）μg/ml，TER最終接種濃度為（0.000 156～0.08）μg/ml。避光、密封，-20℃冰箱保存以備用。

3.藥敏試驗(yàn)：用微量移液器將5種稀釋好的藥物按濃度由高到低依次吸取100 μl接種于96孔板的1～10列，吸取不同種類藥物或不同濃度藥物必須更換移液槍頭，第11列加入100 μl RPMI 1640液體培養(yǎng)基。再將1～11列中分別加入菌懸液100 μl，第12列加入RPMI 1640液體培養(yǎng)基200 μl。即第11列為生長對照孔，第12列為空白對照孔。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 d后讀取結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次取均值。

4.MIC值的判定：每次實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株的MIC值均需在參考范圍之內(nèi)方視為有效。在陽光充足的房間內(nèi)，用肉眼觀察，將各實(shí)驗(yàn)孔與生長對照孔比較。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：4分為濁度不降低；3分為濁度稍降低；2分為濁度顯著降低；1分為濁度基本消失；0分為無濁度。因NCCLS方案里未明確規(guī)定特比萘芬及兩性霉素B的判讀終點(diǎn)，且此兩種藥物作用下的實(shí)驗(yàn)孔無拖尾現(xiàn)象，姑且將特比萘芬和兩性霉素B0分（即肉眼觀察通透、清晰）的試驗(yàn)孔定為MIC判讀終點(diǎn)，氟胞嘧啶、氟康唑及伊曲康唑均以2分（即濁度顯著降低）為判讀終點(diǎn)［10］。

5.評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)NCCLS M27?A2方案推薦的抗真菌藥物對酵母樣真菌耐藥或敏感的界定來解釋實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)。即特比萘芬MIC值≤8μg/ml為敏感，≥32μg/ml為耐藥；兩性霉素B MIC值≤2μg/ml為敏感，≥8μg/ml為耐藥；氟胞嘧啶 MIC值≤4μg/ml為敏感，（8～16）μg/ml為臨界性耐藥，≥32μg/ml為耐藥；氟康唑的MIC值≤8μg/ml為敏感，（16～32）μg/ml為劑量依賴性敏感，≥64μg/ml為耐藥；伊曲康唑MIC值≤0.125μg/ml為敏感，（0.25～0.5）μg/ml為劑量依賴性敏感，≥1μg/ml為耐藥。

6.電鏡標(biāo)本的制備：將特比萘芬組中濃度0.000156 μg/ml、0.00125 μg/ml、0.01 μg/ml、0.08 μg/ml及陽性對照孔中的液體分別收集到5個(gè)無菌試管中，送掃描電鏡室。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0軟件用幾何平均數(shù)及MIC值范圍表示結(jié)果。

結(jié) 果

1.所受試菌株在37℃、培養(yǎng)5 d后陽性對照孔均生長良好，每次試驗(yàn)各質(zhì)控菌株的MIC值均在參考范圍內(nèi)，試驗(yàn)有效。處理數(shù)據(jù)得出各抗真菌藥物對念珠地絲菌的MIC值的幾何平均數(shù)及其范圍（表1）。將各組MIC值幾何均數(shù)與NCCLS推薦的抗真菌藥物對酵母樣真菌敏感性的界定范圍對比，得出念珠地絲菌對各抗真菌藥物的敏感性：特比萘芬、兩性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑均為敏感，伊曲康唑?yàn)閯┝恳蕾囆悦舾小Ｆ渲刑乇容练业腗IC值最低。

2.掃描電鏡可見，受試菌株經(jīng)不同濃度特比萘芬作用5 d后，菌體均發(fā)生了改變。濃度0.000 156 μg/ml時(shí)，鏡下可見菌體表面粗糙、凹凸不平；濃度0.001 25 μg/ml時(shí)，菌體變得皺癟、粗細(xì)不勻；濃度0.01 μg/ml時(shí)，可見不規(guī)則缺損及蟲蝕樣孔洞；濃度0.08 μg/ml時(shí)，可見菌體徹底碎裂；陽性對照組菌體光滑飽滿。見圖1～5。

討 論

近年來，隨著免疫抑制劑、廣譜抗生素的大量使用，導(dǎo)管插管、器官移植、放射治療等廣泛應(yīng)用于臨床，發(fā)生系統(tǒng)性真菌感染的概率也在不斷上升，并且陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些新病種，如阿薩希毛孢子菌引起的播散性毛孢子菌病［11］、肺部奔馬赭霉暗色絲孢霉病［12］等。地絲菌為酵母樣真菌，是一種腐物寄生菌，自然界廣泛存在，亦可為人類皮膚以及胃腸道的正常菌群，白地絲菌為地絲菌屬中的經(jīng)典代表菌種，最常引起侵入性及系統(tǒng)性感染的是頭地絲菌，國內(nèi)外相關(guān)研究較多。念珠地絲菌是新近發(fā)現(xiàn)的一種罕見地絲菌［1］。國內(nèi)已有3例報(bào)道，在此菌的藥物敏感性方面有待進(jìn)一步探討。

表1 5種藥物最低抑菌濃度的幾何均數(shù)及其范圍（μg/ml）

圖1 0.000 156 μg/ml 特比萘芬作用5 d后，菌體表面粗糙不光滑、凹凸不平（SEM×40000） 圖2 0.00125μg/ml 特比萘芬作用5 d后，菌體皺癟、粗細(xì)不一（SEM×15 000）圖3 0.01 μg/ml 特比萘芬作用5 d后，菌體可見不規(guī)則缺損和蟲蝕樣孔洞（SEM×40 000） 圖4 0.08 μg/ml 特比萘芬作用5 d后，菌體呈碎片狀（SEM×40 000） 圖5陽性對照 孢子表面光滑飽滿（SEM×40 000）

本文結(jié)果顯示，該菌對TER、AmB、FC及FCZ均敏感，對ICZ為劑量依賴性敏感。其中特比萘芬的MIC值最低，是念珠地絲菌在體外的最敏感藥物。伊曲康唑?qū)儆趶V譜抗真菌藥，但在本實(shí)驗(yàn)中其敏感性最差，可能體外試驗(yàn)時(shí)受一定環(huán)境因素的干擾，另外也可能與試驗(yàn)菌株本身的敏感性有關(guān)。黃文明等［4］也曾對念珠地絲菌展開體外藥物敏感試驗(yàn)，其研究顯示氟康唑、伊曲康唑、克霉唑、兩性霉素B、制霉菌素高度敏感，酮康唑、咪康唑中度敏感。益康唑、氟胞嘧啶耐藥。而本次的試驗(yàn)菌株對特比萘芬、兩性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶均敏感，對伊曲康唑敏感性較差。黃文明等的試驗(yàn)菌株與我們研究中的菌株僅有3個(gè)堿基的差異，相似率為99.4%，但二者在菌落形態(tài)、API 20c Aux生化鑒定試驗(yàn)及體外藥敏試驗(yàn)上存在明顯差異，黃文明等認(rèn)為這是由于兩者在發(fā)育過程中有性期與無性期出現(xiàn)的表型差異所致。因此，對于地絲菌病的治療，臨床上一方面可依據(jù)以往臨床經(jīng)驗(yàn)選擇用藥；另一方面若能依據(jù)致病菌株的體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇用藥則療效更確切。

特比萘芬為丙烯胺類第二代衍生物，有廣譜抗真菌作用，對皮膚癬菌有殺菌作用，對白念珠菌則起抑菌作用。其主要作用于真菌細(xì)胞膜麥角甾醇合成通路，抑制麥角甾醇的生物合成，而麥角甾醇對于維持真菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性有重要作用，從而使真菌細(xì)胞膜破壞，通透性增加，內(nèi)容物外泄，發(fā)揮其抗真菌作用。本研究對實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)特比萘芬作用后進(jìn)行了電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)菌體出現(xiàn)了皺褶、孔洞和碎片等不同程度的破壞，且隨著藥物濃度的增高，其被破壞的程度逐漸加重，證明特比萘芬對該菌有較大的破壞作用。我科1例由念珠地絲菌所致頭癬的患者，經(jīng)特比萘芬治療后痊愈，這一病例與我們的藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致。本文結(jié)果為臨床治療地絲菌病的抗菌藥選擇提供了新的依據(jù)。

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In vitrosusceptibility ofGeotrichum silvicolato five antifungal agents and electron microscopic observation of terbinafine?treatedGeotrichum silvicola

Wu Lining,Li Chen,Wang Dan,Cao Binglan,Zhu Jingxian
Department of Dermatology,Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China（Wu LN,Zhu JX）;Department of Infectious Diseases,Fifth Hospital of Shijiazhuang,Shijiazhuang 050021,China（Li C）;Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Chengde Medical University,Chengde 067000,Hebei,China（Wang D）;Department of Dermatology,Yuanshi County Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shijiazhuang 051130,China（Cao BL）

ObjectiveTo evaluatein vitroantifungal activities of five clinically common antifungal agents againstGeotrichum silvicola,and to observe morphological changes ofGeotrichum silvicolaafter treatment with terbinafine.MethodsFive antifungal agents commonly used in clinic,including terbinafine（TER）,amphotericin B（AmB）,flucytosine（FC）,fluconazol（FCZ）and itraconazole（ICZ）,were tested in this study.According to the National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）M27?A2 document and relevant literatures,a susceptibility test was performed to determine the minimal inhibitory concentration（MIC）values of the five antifungal agents againstGeotrichum silvicola.Scanning electron microscopy（SEM）was used to observe morphological changes ofGeotrichum silvicolatreated with different concentrations of TER.ResultsThe MIC values againstGeotrichum silvicolawere as follows:TER,0.01 μg/ml;AmB,0.4 μg/ml;FC,2 μg/ml;FCZ,2.69 μg/ml;ICZ,0.25 μg/ml.Geotrichum silvicolawas sensitive to TER,AmB,FC and FCZ,and sensitive to ICZ in a dose?dependent manner.SEM revealed that after TER treatment,the surface ofGeotrichum silvicolabecame rough and shrinking with irregular defects and holes,and even gave a fragment?like appearance.Conclusions Among the five tested antifungal agents,TER shows the strongest activity againstGeotrichum silvicola.Within a certain range,the higher the concentration of TER,the more serious the damage toGeotrichum silvicola.

Geotrichum;Candida;In vitro;Microbial sensitivity tests;Microscopy,electron,scanning;Geotrichum silvicola

Zhu Jingxian,Email:zhujingxian@medmail.com.cn

2015?12?01）

（本文編輯：吳曉初）

朱敬先，Email：zhujingxian@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.09.005